Notch1通路在吸烟诱导人支气管上皮细胞恶性转化过程中对Survivin表达的调控机制及其干预研究

烟草诱发的细胞凋亡与增殖失衡是吸烟导致肺癌发生的核心机制之一。凋亡抑制因子Survivin在肿瘤的发生、发展中扮演重要角色。前期研究表明肺癌细胞株A549中Notch1通路可上调Survivin表达。在吸烟诱导支气管上皮细胞BEPZD恶性转化过程中,发现Survivin、Notch1表达均上调，推测Notch1调控survivin，促进细胞恶性转化。本课题以重度吸烟者支气管上皮和烟草诱导的BEPZD细胞为研究对象，探讨Notch1通路对Survivin表达的调控及其与细胞恶性转化的相关性；阐明PI3K/Akt通路在Notch1对Survivin调控中的介导作用；抑制Notch1和/或PI3K/Akt通路，观察其对细胞恶性转化及小鼠成瘤性的影响；临床随访评估上述分子改变预测罹患肺癌风险的价值。本研究有助于明确吸烟导致肺癌发病的分子机制，亦为高危人群的早期干预提供新的实验依据

利用烟草抽提物(CSC)对永生化支气管上皮细胞BEP2D进行持续诱导至70代，通过细胞形态、克隆形成率、生长曲线、、血清抗性实验、锚着独立生长能力和细胞裸鼠成瘤进行鉴定，成功构建恶性转化细胞P70；采用人基因表达谱芯片方法筛选出Notch、STAT3通路、IKBKE、survivin等激活通路和差异表达基因，qPCR、Western blot等方法证实，Notch1、Notch2、Hes1、JAG2、IKBKE、pSTAT3、IAP家族成员（Survivin、XIAP）等在细胞恶性转化中表达上调，Numb表达下调。通过RT-PCR检测，重度吸烟气道粘膜中，Notch1、Notch2、Hes1、JAG2、IKBKE 、pSTAT3、Survivin表达上调。非小细胞肺癌患者中Notch1、Hes1、pSTAT3、IKBKE和Survivin表达水平均与吸烟相关； Notch阻断剂DAPT和靶向Notch2的慢病毒包装的shRNA作用P70细胞，显著减少了细胞增殖、诱导了细胞凋亡，减少了细胞克隆形成率，裸鼠成瘤实验中显著抑制了皮下肿瘤的形成；Notch通路活化的分子机制研究中首次发现，PCR重测序法证实P70细胞Notch1 CDS区2334R序列存在SNP突变。过表达和免疫荧光实验发现：首次提出Numb负调控Notch2可能是CSC诱导Notch通路激活的分子机制之一。通过对Notch1上游启动子活性分析，预测出C/EBPbeta、 p53等转录因子的潜在结合位点，已成功构建Notch1、Notch2荧光素酶报告基因载体；以A/J小鼠为模型，进行长期烟气暴露成瘤实验，吸烟 3月的A/J小鼠气道粘膜Notch1、Notch2、Hes1、pSTAT3、Survivin和IKBKE等基因表达显著上调。本研究为明确烟草致癌机制及高危人群的早期干预提供了关键实验依据。