‘云红梨1号’果皮着色过程中PyHY5基因功能研究

Yunhongli-1 is a rare and well-colored red pear germplasm resource, and it wins the market by its bright red clolor and high quality. Currently, its coloration mechanism is partially elucidated: firstly light induces the expression of transportation factors MYB, bHLH and WD40 to form the MBW complex, which then activates the expression of key genes of anthocyanin biosynthesis pathway to promote the synthesis and accumulation of anthocyanin. However, how does these transportation factors are regulated by sunlight remains unclear. In Arabidopsis thaliana and Malus sieversii, HY5 is firstly activated by light via phytochrome,and then it regulates the anthocyanin biosynthesis. In this project, the transcription factor HY5 will be cloned, and its antibody will be obtained by prokaryotic expression, protein purification and preparation of HY5 antibody. The DNA fragments associated by HY5 will be isolated by Chromatin Immunoprecipitation technology, and then will be aligned against the promoter sequences of MYB, bHLH and WD40. The interaction between them will be further verified by Gel Shift Assay technology in vitro. Implementation of this project will lay foundation for the thoroughly explanation of the mechanism of the coloration of red pear peel induced by light, and for the peel coloration breeding of pears.

‘云红梨1号’是着色良好的稀有红梨种质资源，因其鲜艳的颜色和上乘品质深受消费者喜爱。目前其着色机理已部分清楚：光诱导转录因子MYB、bHLH和WD40，形成MBW复合物，该复合物通过激活花青素生物合成途径关键基因，从而促进花青皮素的合成与累积。但光如何调控这些转录因子仍不清楚。在模式植物拟南芥和苹果中，光主要通过光敏色素激活HY5蛋白来调控花青素生物合成调控的。本项目拟克隆红梨HY5基因，通过原核表达、蛋白纯化和抗体制备，获得HY5抗体，通过染色质免疫共沉淀技术，分离HY5所结合DNA片段，与MYB、bHLH和WD40启动子进行比对，然后通过体外凝胶阻滞试验来验证HY5与启动子之间的互作。本项目的实施将为光诱导红梨果皮着色机理的彻底解析奠定基础，为梨果皮颜色育种奠定基础。

‘云红梨1号’是着色良好的稀有红梨资源，其着色机理部分已清楚。本研究使用染色体步移法扩增MYB、bHLH和WD40启动子序列，克隆HY5基因，并进行序列比对；通过原核表达、蛋白纯化和抗体制备，获得HY5抗体，通过染色质免疫共沉淀技术，分离HY5所结合DNA片段，通过EMSA试验来验证HY5与启动子之间的互作；并开展了HY5的遗传转化。具体结果如下：1.随着果皮着色面积增加，花青素含量逐渐增加，ANS, PAL, CHS, F3H, DFR和 UFGT 6个花青素结构基因出现上调表达；但CHI基因随着果实脱袋从0到7天，为差异显著上调表达，未套袋时期呈下调表达，但差异不显著。同时bHLH, MYB, WD40 和 HY5调节基因表达为上调。其中HY5含量最高。以上结果表明太阳光照促进花青素的酶活和调节基因，导致了云红梨1号中花青素的合成。2. HY5基因全长为495 bp，编码164个氨基酸，其分子量为17.90 kD，为亲水蛋白，具有bZIP结构域。命名为PyHY5，登录号为：MT508554，证实PyHY5定位在细胞核上。3.扩增出转录因子PyWD40、PybHLH和PyMYB基因启动子的序列，并对其进行比对预测分析，获取PyHY5蛋白结合PyWD40、PyMYB和PybHLH启动子DNA片段信息。4.通过原核表达、蛋白纯化和抗体制备，获得HY5抗体，利用 ChIP-seq 技术对PyHY5蛋白富集的 DNA 序列进行测序和初步分析，证实HY5与MYB、bHLH和WD40显著富集的基序序列中存在共同序列G-box。5.选择7个可能结合的DNA片段并且合成探针，EMSA试验结果显示7个探针均可与PyHY5蛋白结合；选择与PyHY5蛋白结合的PyWD40和PyMYB DNA片段的2个G-box: CACG Motif，结果显示：PyHY5蛋白结合的转录因子的启动子，进而促进了共同表达量。6.建立了PyHY5基因异源表达的遗传转化体系，获得了阳性植株。研究结果阐明了PyHY5蛋白结合转录因子的启动子，进而促进了共同表达量和其表达，导致果皮花青素的合成和累积，在‘云红梨 1号’表型上表现为着红色。为光诱导红梨果皮着色机理的彻底解析奠定基础，为梨果皮颜色育种奠定基础。