云南红梨果皮着色过程中MYB和bHLH转录因子的作用机理研究

红梨是云南省的特色水果，现有早中晚熟三种，早熟红梨最难着色，晚熟红梨着色最好，红梨红色的果皮是花青素的合成和沉积的结果。本项目的前期研究表明在晚熟红梨果皮着色过程中，转录因子MYB、bHLH、WD40及花青素合成关键酶基因的表达水平与花青素含量变化有极好的相关性，均随着光照时间的增加而升高，它们可能参与晚熟红梨果皮着色调控。本项目将应用染色质免疫共沉淀技术分离晚熟红梨果皮着色过程中MYB和bHLH结合的靶DNA，通过靶DNA信息获得其下游靶基因序列，用凝胶阻滞法在体外验证MYB和bHLH与靶DNA结合特性，获知它们调控哪些靶基因的表达。通过转拟南芥和烟草及苹果愈伤组织验证MYB和bHLH的功能，考察它们之间是否有相互作用或与WD40相互作用才能调控花青素合成，阐明它们在红梨果皮着色过程中的作用机理，丰富人们对花青素生物合成转录调控机理的认识，为改良早熟红梨的着色能力奠定理论基础和物质基础。

鉴定云南红梨果皮着色物质，结果证实果皮花青素的主要成分是矢车菊素-3-O-半乳糖苷。运用染色体步移技术扩增出云红梨1号果皮花青素合成途径结构基因PyDFR、PyANS、PyUFGT、PyF3H的启动子片段。运用染色质免疫共沉淀技术和电泳迁移率技术做体内和体外实验分析PyMYB和这些结构基因启动子的结合特性，其结果表明PyMYB能与PyDFR、PyANS和PyUFGT的启动子结合，促进这些基因表达和果皮中花青素的合成。免疫印迹分析曝光0、3、5和 7天的云红梨1号果皮中PyMYB, PybHLH和PyWD40蛋白的表达水平，结果表明随着曝光时间增加，PyMYB和PybHLH蛋白呈明显上调表达，而PyWD40蛋白也略有上调表达，这与果皮花青素含量的变化一致。用COIP分析曝光0和7天的果皮总蛋白中PyMYB, PybHLH和PyWD40蛋白的相互作用，结果表明PybHLH与PyMYB或PyWD40以及PyMYB与PyWD40在体内存在相互作用。通过双分子荧光互补实验证明PyMYB、PybHLH和PyWD40两两相互作用形成的复合物定位于细胞核。通过GST-pull down和Far Western Blot分析证实PyMYB与PybHLH或者PyWD40以及PybHLH与PyWD40在体外能发生相互作用。综合这些结果提出红梨果皮着色的调控模型：云南PyMYB、PybHLH和PyWD40相互作用形成调控复合物，该复合物主要作用于花青素合成途径结构基因PyDFR、PyANS和PyUFGT的启动子上，上调花青素结构基因的表达，促进果皮中花青素的生物合成和累积。从红梨果皮中克隆出PyMYB、PybHLH和PyWD40基因，并分别构建了这些基因的植物表达载体，转化转烟草，拟南芥和矮牵牛，对这些基因功能进行鉴定。结果表明这些基因的过量表达增加转基因植物的耐盐性，在含有5%蔗糖的培养基上生长时花青素的合成量增加。