Orai1/STIM介导SOCE在脓毒症血管内皮细胞钙超载及凋亡的机制研究

Orai/STIM mediated SOC/CRAC is the main mechanism of calcium influx in non-excitable cells. This study aims to explore the role and regultory mechanism of Orai/STIM mediated SOC in burn vascular endothelial calcium overload apoptosis in bun sepsis. Orai1 and STIM knock down mice model of sepsis and HUVEC injured cell model were established to explore the effect of Orai/STIM-SOC mediated by NFkB on calcium influx and apoptosis. Pre-experimental data suggest some NFkB binding sites on the Orai1 and STIM1 promoters and NFkB regulating luciferase activity driven by Orai1 and STIM1. By calcium imaging, patch clamp, reporter gene and gene chips, septic serum induced endothelial Orai1/STIM and NFkB and TLR4 activation and calcium overload and membrane current , exploring these signal molecules involving calcium influx regulation and clarfying the mechanism of Orai/STIM mediated SOC and its regulating signalling to provide a new target to treatment of septic endothelial calcium overload and apoptosis.

Orai1/STIM介导SOC/CRAC是非兴奋性细胞钙内流的主要机制，本研究旨在探究Orai1/STIM介导SOC在烧伤脓毒症血管内皮细胞钙超载及凋亡的作用及调控机制。建立Orai1、STIM基因敲除鼠脓毒症模型及人脐静脉细胞损伤模型，研究Orai1/STIM介导SOC对脓毒症内皮细胞钙内流的作用，及NFkB信号对Orai1/STIM的调控。预实验结果提示：Orai1、STIM1启动子存在NFkB的结合位点，NFkB调节Orai1/STIM介导报告基因活性。应用钙成像、膜片钳及报告基因及基因芯片，研究脓毒症血清诱导内皮细胞Orai1/STIM及调控信号NFkB、TLR4的活化，钙超载及膜电流及凋亡，探寻Orai1、STIM1、NFkB及TLR4信号参与钙离子调节的内在规律，明确烧伤后血管内皮细胞Orai1/STIM调节钙内流及凋亡的作用机制，为寻找烧伤脓毒症内皮钙超载损伤的防治提供新靶

本项目在Orai1/STIM1基因敲除鼠脓毒症动物模型及人内皮细胞损伤模型中，研究Orai1/STIM介导SOC/CRAC在烧伤脓毒症血清或内毒素所致血管内皮细胞钙超载损伤及凋亡中的作用及调控机制。系统建立如下研究平台：（1）siRNA体内转染法构建Orai(-/-）、STIM(-/-）基因缺陷小鼠模型；（2）CLP方法构建Orai1、STIM基因缺陷小鼠脓毒症模型；（3）C57BL6小鼠脓毒症急性肺损伤模型的建立；（4）建立人血管内皮细胞HUVEC钙超载损伤模型；（5）建立选择alarmar blue检测细胞活力的方法，以及H3同位素检测细胞增殖活力的方法，建立特异性拮抗LPS的细胞损伤筛选平台。基于上述实验平台进行深入研究，获得如下结果：（1）证实Orai1、STIM基因缺陷，能显著改善脓毒症急性肺损伤小鼠，肺毛细血管通透性，抑制肺水肿和肺泡-毛细血管膜渗漏，降低脓毒症鼠5天死亡率。（2）证实细菌内毒素刺激血管内皮细胞Orai1、STIM1表达变化，下调Orai1、STIM1表达能显著抑制血管内皮细胞钙内流及细胞凋亡。（3）证实Orai1/STIM介导SOC/CRAC钙通道是内毒素诱导内皮细胞钙超载、炎症及凋亡所必需的。Gd3+、La3+或2-APB等阻断细胞膜SOC/CRAC通道，细菌内毒素诱导的血管内皮细胞钙内流显著下降，NFkB下游炎症介质如TNF、ICAM-1、ET-1表达水平显著下降。（4）证实细菌内毒素刺激血管内皮细胞Orai1、STIM1、TLR4及其下游信号BTK、PLC及NFkB的表达活化，或者磷酸化。（5）证实下调Orai1、STIM、BTK、PLC、NFkB能显著抑制细胞钙内流，以及抑制细胞凋亡蛋白caspase-3表达。（6）证实Orai1、STIM1基因启动子上存在NFkB的潜在结合位点,即NFkB反应元件GGAATTTCC。（7）证实转录因子NFkB对Orai/STIM介导SOCE的调控作用。（8）证实肾上腺酮类似物、叶酸类似物具有特异性拮抗细菌内毒素诱导脓毒症的作用。较系统地阐明Orai1/STIM介导SOC信号在调节细胞内钙内流、超载、凋亡过程中的关键作用，探索Orai1/STIM1与其它钙调节信号TLR4、Btk、转录因子NFkB以及PLC激酶信号的内在联系，明确调控Orai1/STIM1表达的信号机制，为寻找烧伤后细胞内钙超载