Na+/HCO3-共转运通道NBCn1在胆道HCO3-保护屏障形成和缺血型胆道病变中的作用研究

One of the mechanisms of ischemic-type biliary lesions (ITBL) after liver transplantation is the toxic effect induced by bile salts. To protect the cholangiocytes from injury of bile salts, the biliary epithelium developed the HCO3- barrier which has been proven recently. Our previous studies have confirmed the vital role of electroneutral Na+/HCO3- cotransporter-1 (NBCn1) in the formation of gastrointestinal HCO3- protective barrier, and we also demonstrated that the biliary HCO3- secretion decreased significantly in the early stage of biliary ischemic stenosis mice model. To the best of our knowledge, the physiological significance of NBCn1 in biliary HCO3- protective barrier still remains unknown, and the effect and related molecular mechanisms of biliary HCO3- protective barrier in development of ischemia-related biliary injury have not been clarified yet. In the planed work of this grant, the NBCn1 knockout mice and the mice model of biliary ischemic stenosis are employed, the biliary HCO3- secretion, biliary epithelium intracellular pH regulation, intracellular trafficking and function of HCO3- secretion related ion transporters are evaluated. We believe that this work will clarify the action and related molecular mechanisms of NBCn1 in biliary HCO3- protective barrier, uncover the role and involved mechanisms of biliary HCO3- protective barrier malfunction in biliary injury due to ischemia, and finally provide us the clues for effective ways about prevention and intervention of ITBL after liver transplantation.

胆盐导致的细胞毒性作用增强是肝移植术后缺血型胆道病变（ITBL）发病机制之一，胆道HCO3-屏障是保护胆管上皮细胞免受胆盐侵袭的重要因素。我们已经证明Na+/HCO3-共转运通道NBCn1是形成胃肠道HCO3-屏障的重要离子通道，同时发现胆道HCO3-分泌能力降低是小鼠缺血型胆管狭窄病变进程的早期事件，但NBCn1在胆道HCO3-屏障形成的作用及内在机制、HCO3-屏障在缺血型胆管狭窄中的作用及离子通道分子机制尚不清楚。本项目以NBCn1基因敲除小鼠和小鼠缺血型胆管狭窄模型为研究对象，检测胆道HCO3-分泌、胆管上皮细胞内pH值调节、HCO3-分泌相关离子通道功能和细胞内定位表达，阐明NBCn1在胆道HCO3-屏障形成的作用及内在机制，揭示HCO3-屏障在缺血型胆管狭窄中的角色及离子通道基础，深化胆道HCO3-屏障分子机制的认识，为肝移植术后ITBL的防治提供新的参考思路。

胆盐导致的细胞毒性作用增强是肝移植术后缺血型胆道病变（ITBL）发病机制之一，胆道HCO3-屏障是保护胆管上皮细胞免受胆盐侵袭的重要因素。我们前期工作发现已经证明电中性Na+/HCO3-共转运通道（NBCn1）是形成胃肠道HCO3-屏障的重要离子通道，同时发现胆道HCO3-分泌能力降低是小鼠缺血型胆管狭窄病变进程的早期事件。本项目就胆道HCO3-屏障形成的分子机制、肝移植术后ITBL发病的危险因素开展了一系列的研究。本项目首先证实了NBCn1在胆管细胞管腔侧细胞膜呈弱表达，而生电性Na+/HCO3-共转运通道（NBCe1）在胆管细胞管腔侧细胞膜呈强表达；并发现NBCn1野生型（WT）及基因敲除（KO）小鼠的胆汁分泌量、胆汁HCO3-分泌量以及胆汁中HCO3-浓度均无明显差异；然而NBCe1 WT小鼠的胆汁能碱化生理盐水，但NBCe1 KO小鼠胆汁并无此现象；同时胆总管组织mRNA表达研究显示ITBL模型组的阴离子交换蛋白2（AE2）表达较假手术组明显降低，同时NBCe1表达低于假手术组，但缺乏统计学差异；而NBCn1和囊性纤维化跨膜传导调节因子（CFTR）表达均无明显变化。根据基础研究实验结果，我们推测（1）NBCn1在胆道HCO3-保护屏障形成中并不扮演重要角色。（2）NBCe1可能参与了胆道HCO3-保护屏障形成。（3）NBCe1和AE2可能参与了缺血型胆道病变的发病机制。随后通过临床心脏死亡供体（DCD）肝移植的临床数据分析，本课题组发现供肝大泡性脂肪变≥30%和中性粒细胞浸润是有效评估供肝质量、预测移植后肝脏存活率的重要指标；但DCD供肝组织病理学检测指标（包括大泡性脂肪变、肝窦中性粒细胞浸润、肝窦淋巴细胞浸润、肝细胞淤胆、肝细胞肿胀、肝细胞坏死）对肝移植术后ITBL的发生并无预测作用；而供体捐献前血清白蛋白<23g/L以及ABO血型不合是肝移植术后ITBL的危险因素。此外研究表明肝移植术前 血小板淋巴细胞比值（PLR）升高与肝移植术后HCC复发密切相关，PLR与杭州标准联合有效拓展的肝癌肝移植的受体选择标准。本课题的临床部分研究结果为DCD肝移植临床实践中的供肝质量评估、供肝质量保护、肝癌肝移植的受体选择标准以及ITBL的预防提供了循证医学证据。