母菊MrSTS1基因在α-甜没药醇合成中的调控机制研究

α-Bisabolol is one of the major active components from Matricaria recutita L., a kind of herb plants, and had important medicinal value. In our previous study, a sesquiterpene synthase gene, designated as MrSTS1, was screened from the transcriptome database of M. recutita. Subsequently, we assayed the in vivo enzyme activity of MrSTS1 overexpressed in yeast and analyzed the function of MrSTS1 using transformation of tobacco transient expression system. The results showed that MrSTS1 might be a key gene involved in the biosynthesis pathway of α-bisabolol in M. recutita. Therefore, the present study intends to investigate the spatial and temporal expression pattern of MrSTS1 gene using real-time PCR method, and determine the content of α-bisabolol in the meantime. The regulation role of MrSTS1 in the accumulation of α-bisabolol would be discussed according to the correlated relation between MrSTS1 transcript level and α-bisabolol content. In addition, we will construct the sense and RNAi expression vector of MrSTS1 and then transformed into M. recutita. The role of MrSTS1 in regulating α-bisabolol biosynthesis will be identified based on function analysis of the transformation. At last, in order to reveal the molecular mechanism of MrSTS1 regulating the biosynthesis of α-bisabolol, the MrSTS1 promoter will be isolated by genomic walking and characterized using transgenic method. The results of this study will provide the theory basis and gene resource for improving the content of α-bisabolol by genetic engineering technology in M. recutita.

α-甜没药醇是香草植物母菊的主要活性成分，具有重要的药用价值。申请者前期从母菊转录组数据库中筛选到1个倍半萜合成酶基因MrSTS1，酵母超表达酶活检测与转化烟草瞬时表达结果表明MrSTS1可能是α-甜没药醇合成途径中的1个关键基因。据此，本项目拟以母菊为试材，1.利用qRT-PCR技术检测MrSTS1的时空表达谱，同时采用GC-MS技术测定α-甜没药醇含量，通过分析MrSTS1表达量与α-甜没药醇含量之间的相关性，探讨MrSTS1在α-甜没药醇积累过程中的调控作用；2.构建MrSTS1的正义和RNAi表达载体，对母菊进行遗传转化，通过转基因功能分析进一步验证MrSTS1对α-甜没药醇合成的调控功能；3.克隆MrSTS1的启动子，通过研究MrSTS1启动子的功能，解析MrSTS1调控α-甜没药醇生物合成的分子机制。本研究结果可为利用基因工程技术提高母菊α-甜没药醇含量提供理论依据和基因资源。

母菊又称洋甘菊，一年生草本植物，因富含倍半萜等挥发性芳香油活性成分而具有重要的药用价值。本项目以母菊为试材，利用RNA-Seq技术挖掘洋甘菊倍半萜化合物代谢途径中的关键基因MrSTS1，基于启动子功能分析结果解析了MrSTS1调控α-甜没药醇合成的功能；克隆鉴定了α-甜没药醇合成代谢过程中的重要结构基因，鉴定了部分基因参与母菊α-甜没药醇生物合成的功能；建立了母菊组织培养体系，为进一步利用转基因技术研究MrSTS1的功能奠定了基础；研究了ALA处理对母菊α-甜没药醇含量的影响机制。主要研究成果如下：（1）筛选了倍半萜合成代谢中的关键基因：通过RNA-seq技术分析了母菊根、茎、叶、花的转录组表达谱，检测了不同器官中倍半萜的成分和含量，筛选了与倍半萜合成积累密切相关的差异基因，确定了α-甜没药醇合成途径中的关键基因，丰富了倍半萜合成代谢的相关基因资源。（2）克隆了MrSTS1的启动子，利用转基因技术解析了MrSTS1启动子的调控功能，进而初步阐明了MrSTS1基因在α-甜没药醇合成中的调控机制。（3）克隆了α-甜没药醇合成代谢过程中的重要结构基因HMGS、HMGR、AACT和TPS1-3，并鉴定了部分关键基因参与母菊α-甜没药醇生物合成的功能，通过表达分析和功能验证弄清了关键基因调控母菊α-甜没药醇合成的分子机制。（4）建立了母菊组织培养体系：通过筛选外植体、消毒方法、培养基等研究确定了母菊组织培养的最佳条件，建立了母菊组织培养体系。（5）探明了ALA提高母菊α-甜没药醇含量的生理机制：ALA处理促进母菊光合作用产物、可溶性蛋白、总氨基酸、相关抗氧化酶活性以及α-甜没药醇的含量，通过分析α-甜没药醇含量与光合作用产物及抗氧化酶活性之间的相关性，初步揭示了ALA提高母菊α-甜没药醇含量的生理机制。上述研究结果为进一步解析母菊中α-甜没药醇合成代谢通路奠定了理论基础，为通过基因工程、细胞工程技术提高母菊中α-甜没药醇含量提供了理论依据和实践指导。