淀粉分支酶SBEIIb和SBEI通过多酶复合物调控玉米胚乳中直链淀粉合成机理研究

Recent studies showed that protein interaction plays an important role in the process of starch biosynthesis. Our previous research indicated that the key enzyme starch branch enzyme SBEIIb could interact with AGPase to form a multi-enzyme complex. In this study, single gene mutant (sbeIIb) high amylose inbred lines SDAF11 and double the genetic mutant (sbeIIb and sbeI) ultra-high amylose inbred lines GEMS-0067 were used as materials. Scanning electron microscopy (sem), two-dimensional affinity blue native page, liquid chromatography tandem mass spectrometry and yeast two hybrid system were used to analyze the following matters: the effect of sbeIIb and sbeI mutation to the starch grain structure, the activity of starch branching enzyme and the formation of multi-enzyme complexes; the protein interactions pattern in the multi-enzyme complexes which contain SBEIIb and/or SBEI. Hopefully, this research would reveal the mechanism of SBEIIb and SBEI regulating the biosynthesis of amylose in endosperm by forming multi-enzyme complexes and make significant effort for the regulation network of maize starch metabolic pathway research.

最近的研究结果表明蛋白质相互作用在玉米胚乳淀粉生物合成中发挥重要作用。申请人前期工作中发现直链淀粉合成中最关键的限速酶淀粉分支酶SBEIIb能够与AGPase等发生紧密的蛋白互作，进而形成多酶复合物。这些复合物被猜测在调控直链淀粉合成方面发挥关键作用。本研究以单基因(sbeIIb)突变的高直链淀粉玉米自交系SDAF11、双基因(sbeIIb和sbeI)突变的超高直链淀粉玉米自交系GEMS-0067为材料，利用电镜扫描技术、二维温和胶亲和层析-液相色谱串联质谱技术、酵母双杂交技术等，详细分析sbeI、sbeIIb等位基因突变对玉米胚乳中淀粉粒结构的影响、淀粉分支酶活性的影响、多酶复合物形成的影响，以及含有SBEIb和/或SBEI多酶复合物中蛋白互作模式，揭示SBEI、SBEIIb如何通过形成动态的多酶复合物调控胚乳直链淀粉生物合成。研究的顺利进行对解析复杂的玉米淀粉合成代谢调控网络意义重大

本课题以直链淀粉合成代谢过程中限速催化酶淀粉分支酶SBEI和SBEIIb为研究对象，以SDAF11和GEMS-0067两份特殊遗传背景的玉米自交系为研究材料，以普通玉米Mo17为对照，通过比较分析SBEI、SBEIIb等位基因突变对玉米胚乳中淀粉粒结构、淀粉分支酶、多酶复合物动态形成的影响，揭示SBEI、SBEIIb通过形成动态的多酶复合物调控胚乳中直链淀粉生物合成的详细作用机制。研究结果如下：（1）SDAF11和GEMS-0067中多酶复合物与普通玉米中明显不同。酵母双杂交和双分子荧光淬灭试验证实SDAF11和GEMS-0067中SBEIIb第九个外显子的缺失，导致其与核心互作蛋白ADPGases bt2小亚基不再结合，进而导致整个多酶复合物解离；（2）sbeIIb第九个外显子缺失区段为酶催化活性的核心区域，导致淀粉分支酶SBEIIb活性消失；（3）二维亲和电泳研究表明SBEI参与形成的多酶复合物不与淀粉及其中间产物相结合。sbeI的多个有义突变显著降低了淀粉分支酶SBEI的活性，但对淀粉结合型复合物的形成无影响；（4）sbeIIb单基因突变对淀粉粒形状有明显的影响，但对淀粉粒的数量影响不大。sbeI和sbeIIb双基因突变不但改变了淀粉粒的形状，还显著增加了淀粉粒的数量；（5）SBEIIb淀粉分支酶活性降低是导致突变体中直链淀粉合成增加的主要原因，而SBEIIb与ADPGases bt2蛋白互作的消失是导致突变体中总淀粉含量剧烈下降的主要原因；（6）转基因研究发现单一抑制 SBEIIb，玉米胚乳中直链淀粉含量上升，单总淀粉含量剧烈下降；单一过表达ADPGases bt2小亚基玉米总淀粉含量不但没有增加，反而显著降低。 根据上述研究结果推测ADPGases bt2与SBEIIb的蛋白互作很可能是一个动态的调控过程，一方面使两个酶促反应在空间上更加接近，有效地加速了底物流转，加速了支链淀粉的合成。另一方面ADPGases bt2由受其他蛋白影响，通过变构动态的调控代谢流在淀粉合成和糖酵解之间转换。研究结果证实两个重要的淀粉代谢酶类SBEIIb和ADPGases bt2在玉米淀粉合成中不仅发挥自身酶促反应作用，还直接参与调控其他代谢途径，这为研究人员深入了解复杂的淀粉代谢网络提供了新的线索和基础实验数据，也为转基因或基因聚合开展高直链淀粉玉米新品种培育提供了新的思路。