真核细胞中LepA同源蛋白的功能研究

LepA蛋白是最近发现的、在原核生物的蛋白质翻译过程中具有"反转运"功能的核糖体作用因子。生物信息学预测LepA在真核生物中也非常保守，可能定位于线粒体/叶绿体中，暗示其功能的重要性。但，目前LepA真核同源蛋白GUF1的研究还是空白。在本课题中，我们将展开GUF1蛋白在高等真核细胞中的功能研究。通过RNA干扰技术获得GUF1沉默表达的细胞株。在此基础上，比较细胞在正常条件下和生理压力条件下，线粒体蛋白质合成、线粒体膜电位、呼吸链氧化磷酸化活性、活性氧产生、细胞凋亡等方面的改变。此外，我们还将利用基因芯片和差异蛋白质组学的方法，分析GUF1蛋白可能参与的调控网络。综合以上结果，初步探明GUF1蛋白在高等真核细胞中的功能及作用网络，探讨线粒体蛋白质翻译与细胞命运之间的相互关系。

LepA蛋白是最近发现的在原核生物蛋白质翻译过程中具有“反转运”功能的核糖体作用因子，因此被成为EF4（elongation factor 4）。生物信息学研究表明，主要存在于线粒体/叶绿体中的EF4蛋白在真核生物中也非常保守，由此暗示了其功能的重要性。但目前对EF4真核同源蛋白GUF1 (GTPase of unknown function 1)的研究仍是空白，因此，我们将对GUF1（以下称为EF4）蛋白在高等真核细胞中的功能进行研究。我们的实验结果表明EF4蛋白沉默可引起细胞增殖减慢，细胞内ROS上升以及线粒体数量的增加，并且更加容易诱导EF4沉默细胞的凋亡。为了进一步探索EF4在真核细胞中的功能，我们检测了在正常培养真核细胞的条件下，EF4蛋白沉默对线粒体膜电势、ATP合成、细胞耗氧量以及线粒体内各复合物蛋白质水平和复合物活性的影响。研究结果发现，EF4基因沉默导致线粒体膜电势下降，ATP水平下降，氧气消耗速率明显下降。同时我们检测了线粒体呼吸链复合物的含量以及酶活性。实验结果显示，EF4基因沉默后，线粒体呼吸链复合物含量及其活性有明显的变化。这可能与EF4对线粒体翻译的影响有关。干扰EF4时，线粒体的蛋白质翻译速率降低。这说明了EF4蛋白在线粒体蛋白质翻译过程中的作用。我们进一步的研究发现，在人类癌症细胞中EF4蛋白对线粒体功能具有重要的调控作用。EF4蛋白编码基因的沉默可以有效地抑制人癌症细胞的生长。