研究CLDN19在眼生理和病理中的作用及构建新的人RPE细胞系

The CLDN19 mutations caused familial hypomagnesemia with hypercalciuria and nephrocalcinosis (FHHNC) and also caused severe visual impairment, characterized by macular colobomata, horizontal nystagmus, and significant myopia. Our studies found that CLDN19 is a very important tight junction protein and expressed Predominantly in human RPE. We also found human ARPE-19 cell line lost CLDN19, however we don’t know whether CLDN19 losing is really reason of ARPE-19 cell resemble a functionally pathologic blood-retina barrier or aged RPE. Coincidently, lower animals without macular construction and fine vision such as mice and chicken haven’t expressed CLDN19. So, we put forward a hypothesis that CLDN19 must be highly related to macular development and fine vision. .This study will use the latest tool in genome editing – CRISPR/Cas9 to insert CLDN19 gene back to the genome of ARPE-19 cells. Then we will investigate activation of a downstream gene or pathway and function or role of CLDN19 gene in RPE. A new cell line will be developed through the positive clonal selection. The new constructed RPE cell line with CLDN19 expression will be a good cell culture model for the research of blood-retina barrier and RPE function in vitro..For in vivo studies, we will select miniature pigs as animal model. The miniature pig has a streak-like macular in the retina and the CLDN19 expression in RPE. We will inject siRNA-CLDN19 into the vitreous of pig eye to reduce the expression of CLDN19 in retinal blood vessel and RPE, which will open or break down blood-ocular barrier. Then we will investigate the function of the blood-retinal inner barrier and blood-retinal outer barrier by Fundus fluorescein angiography (FFA) or Indocyanine green angiography (ICGA). The visual function of the retina will be evaluated through Electroretinography (ERG). Finally, we will elucidate the function of CLDN19 on macular visual physiology and pathological mechanism in some related disease. It will provide a new target of drug development and treatment on blood-retina barrier regulation as well.

紧密连接蛋白CLDN19突变导致黄斑缺损、眼球震颤等。我们发现 CLDN19 极高表达于人眼RPE，而似病理状态的人ARPE-19细胞系恰恰丢失了CLDN19。且无黄斑结构的鼠、兔和鸡眼RPE均缺失CLDN19，因此CLDN19很可能与黄斑发育和精细视觉高度相关。本课题采用最新的 CRISPR/Cas9基因组编辑技术将CLDN19基因插回ARPE-19细胞的基因组中，研究其激活的下游基因或信号通路并研究其在RPE中的功能。并通过阳性克隆筛选一个新的RPE细胞系，为体外研究提供一个更好的细胞系。用有CLDN19表达的微型猪作为体内研究的动物模型，通过玻璃体内注射siRNA-CLDN19来降低CLDN19在网膜血管内皮和RPE层的表达， 以FFA、ICGA和ERG检测血－视网膜内、外屏障和视觉功能。最终揭示CLDN19在眼视觉生理病理中的作用，也为调控血－视网膜屏障的药物开发和治疗提供新靶点。

研究背景：紧密连接蛋白CLDN19基因突变导致罕见的2型家族性遗传病，主要表现为低镁血症、高尿钙及肾钙沉积（FHHNC），同时也导致严重眼疾病包括黄斑缺损、高度近视、眼球震颤及视网膜变性等，称之为FHHNCOI。我们前期研究发现 CLDN19 极高表达于人眼 RPE，而似病理状态的人ARPE-19细胞系恰恰丢失了CLDN19，值得研究。研究内容：我们对CLDN19在眼内不同部位的RPE上的表达、分布，CLDN19在RPE细胞和动物眼发育中的作用和蛋白信号功能及在FHHNCOI中致病机理进行了深入的研究，同时对ARPE19细胞系进行改良，拟构建一个更符合生理状态的RPE细胞系。研究结果和数据：CLDN19在小鼠RPE、猪的RPE、人的RPE是持续表达，而在小鼠视网膜中一过性表达，虽然CLDN19在猪眼内不同部位的RPE上的分布和表达没有检测到明显的不同。但我们通过腺病毒将CLDN19过表达于ARPE19细胞，可以通过AKT信号通路调节调节RPE重要基因的表达并部分恢复ARPE-19细胞的细胞表型和屏障功能。但通过CRISP R/Cas9基因组编辑技术将CLDN19基因插回ARPE19细胞的基因组中去克隆筛选一个新的RPE细胞系的工作还在进行中，因单细胞克隆很难存活，特别是RPE细胞。我们通过AAV病毒构建了表达人类疾病来源CLDN19点突变（p.G20D和 p.R81W）的小鼠模型，发现突变CLDN19导致严重的视网膜变性及视觉损伤。表达p.G20D突变的小鼠模型很早便出现伴随ERG受损的视网膜变性、视网膜结构的紊乱、视网膜神经元凋亡的增加以及内部视网膜神经元的破坏。从而证实了突变CLDN19导致遗传性眼病的基因型与疾病表型的关系。给予外源性的类视黄醛物质治疗部分恢复了视觉功能。科学意义：CLDN19即是稳定RPE外屏障结构的紧密连接蛋白，而且是一种重要的信号转导蛋白，通过AKT信号通路调节其他重要RPE基因的表达。在眼视网膜组织发育中具有重要作用，也第一次为CLDN19突变导致遗传性眼病的基因型及临床表型关系提供了证据。同时提示突变CLDN19蛋白不能定位至细胞膜及其丧失了调节RPE重要基因表达的功能可能是其导致FHHNCOI的原因。视黄酸治疗可能是FHHNCOI治疗的一种有效手段。另外也发现可能影响RPE的自噬和吞噬功能（还在研究中）从而揭示老年黄斑变性疾病的形成