用分子对接及SPR法检测尿液中膀胱癌肿瘤标志物

针对泌尿系最常见的膀胱癌早期诊断和监测复发手段有待提高的现状。本研究将探讨一种创新、简便、价廉、敏感、特异的用于尿液中大分子蛋白和肿瘤标记物检测的方法。以尿液肿瘤标志物基质金属蛋白酶9（MMP9）和纤维连接蛋白(FN)为研究对象和切入点，利用分子对接技术在大分子物质特异性识别上的优势，寻找能与MMP9和FN特异性结合和亲合性强的小分子配体；并对其进行合成。利用表面等离子共振生物传感器（SPR）具有高灵敏度和特异检测分子之间相互作用及不需进行标记的优点，将配体包被在芯片上，对肿瘤标记物与小分子配体间的结合情况进行高敏感度的检测。实现对尿液中的肿瘤标志物高灵敏性和高特异性的检测。与ELISA方法对比，评价该方法的检验效能及临床应用的可行性。建立用分子对接及SPR技术检测尿液肿瘤标志物和大分子蛋白的方法和技术参数。为膀胱肿瘤诊断和尿液大分子蛋白的检测提供新思路。为临床应用提供基本数据。

膀胱癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤，膀胱镜检查和尿细胞学检查是目前膀胱癌诊断的主要技术，但是前者是有创检查且检查费用较高，后者的敏感性低。近年来国内外学者在探索用尿液肿瘤标志物来筛查或早期诊断膀胱癌。本课题的研究目的是设计一种创新、简便、价廉、敏感、特异的用于尿液中大分子蛋白和肿瘤标记物检测的方法。本课题组以尿液肿瘤标志物基质金属蛋白酶9（MMP9）为主，利用分子对接技术在大分子物质特异性识别上的优势，设计出一系列可能与MMP9特异性结合且亲和力强的小分子探针，然后通过有机化学的方法探索最佳合成路线对其进行合成，以质谱、核磁谱进行验证，然后利用表面等离子体共振技术（SPR）将小分子探针包被在SPR芯片上，当MMP9蛋白溶液流过SPR芯片表面时二者发生反应，通过此时共振角的变化来检测溶液中的MMP9与小分子探针的结合情况。进过反复探索我们成功地将小分子探针固定在SPR芯片上，检测后SPR共振角变化明显，与溶液中的MMP9蛋白作用后共振角也发生变化。为了进一步确定小分子探针与MMP9蛋白结合的特异性，我们建立了用SPR法固定大分子检测小分子的实验路线。经过现阶段的探索，我们已经完成了MMP9小分子的设计，找出了其最佳的合成路线，经过验证其结构正确，并创新性地探索出了在SPR芯片表面固定小分子来检测大分子的方法（目前为止这种用SPR固定小分子来检测大分子的研究在表面化学的领域还未见报道）同时得到如下启示：要提高监测的特异性和灵敏度，下一步需要优化实验方案，用SPR固定大分子来检测小分子的方法，确定小分子探针与MMP9蛋白是否能够结合以及结合的特异性，并设立阴性对照白蛋白组与MMP9蛋白组同时进行SPR检测。由于分子对接技术对大分子物质的特异性识别优势、SPR生物传感器具有高灵敏度检测分子之间相互作用且无需标记的优点，用此种方法来实现对尿液中的肿瘤标志物高灵敏性和高特异性的检测完全是有可能的。