低温嘌呤核苷磷酸化酶在利巴韦林发酵中的应用基础研究

利巴韦林是一种具有高效广谱抗病毒作用的核苷类似物，在医药工业中应用广泛。本项目采用代谢工程技术在鸟苷产生菌（枯草芽孢杆菌）中导入利巴韦林合成关键酶-低温嘌呤核苷磷酸化酶（PNPase）基因，通过鸟苷代谢途径的延伸，实现鸟苷产生菌向利巴韦林产生菌的改造。主要研究内容：① 克隆鉴定多种属嗜冷微生物的低温PNPase基因；通过序列比对、三维结构模拟和酶学性质分析，研究与酶活性和适应性相关的关键位点和基因序列；通过定点突变筛选获得催化效率更高和适应性更好的低温PNPase；② 将改良的低温PNPase基因导入鸟苷产生菌，增加受体菌的PNPase活性，解决常温发酵条件下PNPase活力低和催化效率低的技术难题，研究PNPase活性对利巴韦林积累的影响。本项目研究将为利巴韦林的微生物制造技术奠定理论基础和提供实践依据，并对其它核苷衍生物的生产和开发利用提供新的思路。本项目预期发表SCI文章3篇。

利巴韦林是一种具有高效广谱抗病毒作用的核苷类似物，在医药工业中应用广泛。本项目采用代谢工程技术在核苷产生菌（芽孢杆菌）中导入利巴韦林合成关键酶-嘌呤核苷磷酸化酶（PNP）基因，通过核苷代谢途径的延伸，实现核苷产生菌向利巴韦林产生菌的改造。本课题组在核苷的合成代谢方面已有多年研究基础，选育了多株核苷生产菌。在此工作基础上，本研究通过三个部分的研究，成功实现了将核苷生产菌改造成为利巴韦林生产菌。. 第一部分，首先克隆并纯化了嗜冷微生物假交替单胞菌Pseudoalteromonas sp. XM2107的低温PsPNP，它具有比来源于枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis168和大肠杆菌E. coli K-12的PNP更低的反应温度。利用定点突变技术研究了关键氨基酸位点对PsPNP催化效率的影响，其中单突变株T90R和T156S的催化效率分别提高了53.5倍和17.5倍，而双突变株T90R：T156S的催化效率提高了202.3倍。. 第二部分，构建了芽孢杆菌的蛋白表达和转化系统，成功克服了菌体自身限制-修饰系统对转化的影响。在此基础上以鸟苷生产菌和腺苷生产菌为对象，通过强化核苷合成途径关键酶的转录水平达到了提高核苷合成量的目的。其中串联表达prs与purF基因和单独表达guaB基因分别使鸟苷产量提高14.4%和20.7%；通过部分强化pur操纵子，使得腺苷产量提高了17.5%。. 第三部分，经过多次尝试与优化，低温PNP始终未能在芽孢杆菌中表达，而来源于枯草芽孢杆菌的同源三聚体PNP816不仅能够顺利表达，同时还表现出了较强的催化效率。比较发现鸟苷生产菌解淀粉芽孢杆菌B. amyloliquefaciens TA208为发酵法生产利巴韦林的最适宿主，同时采用分泌方式表达PNP816能够起到提高催化效率的作用。在摇瓶水平下发酵96 h可积累利巴韦林17.2 g/L，经过对发酵条件的优化后，利巴韦林的积累量可达到27.1 g/L。在7.5 L发酵罐分批发酵实验中，发酵60 h可积累利巴韦林23.8 g/L，大幅度缩短了发酵周期。