核苷磷酸化酶在毕赤酵母系统中的高效分泌表达及在食品添加剂I+G合成中的应用基础研究

核苷磷酸化酶能够催化无机磷酸根特异地转移到核苷中核糖分子第5'-位碳原子羟基上，具有位置特异性强，环境友好等特点，对核苷磷酸化生产I+G具有独特的优势和潜力。然而核苷磷酸化后，跨膜传递阻力增大，难以透过细胞膜，进而被胞内核苷水解酶降解，造成转化率低，副产物多，限制了酶法核苷磷酸化大规模应用。针对该问题，本项目拟以本实验室前期筛选获得的具有较高核苷磷酸化酶活力的微生物为出发菌株，通过PCR技术或构建DNA文库获得编码核苷磷酸化酶基因；根据PDB数据库已有的大肠杆菌核苷磷酸化酶蛋白晶体结构为模板进行同源模建，推测酶催化的活性位点，通过定向进化对酶定点突变，并根据毕赤酵母的密码子偏好性，对该基因序列进行优化设计和改造，构建诱导型表达载体，再电转化毕赤酵母，以实现核苷磷酸化酶在毕赤酵母中的高效分泌表达；最后对重组酶催化肌苷和鸟苷磷酸化过程进行研究，为I+G的绿色低成本生产技术奠定坚实的理论基础。

核苷磷酸化酶能够催化无机磷酸根特异地转移到核苷分子5’-位碳原子羟基上，具有位置特异性强，环境友好等特点，对肌苷与鸟苷磷酸化生产I+G具有独特的优势和潜力。首先，本项目成功获得来源于Escherichia blattae的核苷磷酸化酶，根据PDB数据库中已公布的核苷磷酸化酶蛋白晶体结构，并且以底物肌苷为配体，将两者在对接软件Discovery Studio 2.5中进行分子对接，选择突变点，并对此设计引物，采用点饱和突变技术进行分子改造，最终得到突变菌株E. coli BL21(DE3)/pET28b-AP/PT-D108S/N143L，与突变前E.coli BL21 (DE3)/pET28b-AP/PTase相比，酶活力提高了8.2倍。其次，对成功构建的重组磷酸化酶进行固定化，优选海藻酸钠-聚乙烯醇-活性炭共固定化为最佳方法，确定了共固定化条件为活性炭浓度1.0%，海藻酸钠浓度2.0%，聚乙烯醇浓度6.0%，CaCl2浓度2.0%，菌体包埋量6g/100mL凝胶溶液，固定化时间6 h。固定化细胞在重复使用12批后相对酶活力仍保持54.5%，具有良好的操作稳定性。再次，根据毕赤酵母的密码子偏好性，对突变体AP/PT-D108S/N143L基因序列进行优化设计和改造，构建诱导型表达载体，再电转化毕赤酵母GSll5感受态，成功实现了核苷磷酸化酶在毕赤酵母中的分泌表达。在5 L发酵罐中对突变菌株产酶条件进行了考察，确定了最佳产酶培养条件为：接种量为2%，通气量为1.5 L/min，搅拌转速为500 rpm，诱导时机为OD600为6左右，最终得到突变菌株的酶活和生物量分别为5080.02 U/L和14.04 g/L。最后，考察了影响静息细胞催化肌苷生成5′-IMP的条件，确定了最佳反应体系：35˚C，100Mm，pH 4.0的醋酸钠缓冲液，菌体浓度为60g/L，肌苷浓度为35 mg/mL，焦磷酸钠浓度为250 mg/mL。结果表明，在此条件下的产率为90.6%。本项目的研究，能够为I+G的绿色低成本生产技术奠定一定的理论基础。.综上所述，本项目全面完成了预期的研究内容，共发表期刊论文5篇，申请中国专利1项，另外待投稿论文1篇。