Elmo1-Nck 的相互作用在肝细胞癌侵袭和转移中的作用研究

衔接蛋白Nck通过调节细胞骨架蛋白的成核作用，对细胞的形态和运动具有重要作用。申请者在前期工作中发现了一个新的Nck相互作用蛋白- - -Elmo1，且Elmo1在肝细胞癌（HCC）组织中的表达显著高于正常肝组织，在高转移肝癌细胞系中的表达也高于低转移和无转移能力的细胞：提示Elmo1可能通过与Nck 的相互作用引起细胞骨架改变，促进肿瘤细胞的迁移。由于我们发现Elmo1结合于Nck的SH2结构域(酪氨酸磷酸化残基的结合区域)，本研究拟采用免疫共沉淀和GST-pulldown实验进一步验证Elmo1与Nck的相互作用，明确其相互作用是否依赖于Elmo1的磷酸化，并确定作用位点。最后，通过细胞和动物实验检测Elmo1 的表达变化对细胞迁移和肿瘤侵袭的影响，阐明Elmo1-Nck-WASP-Arp2/3这一新途径在调控细胞骨架系统，促进细胞运动中的作用，进一步揭示HCC侵袭、转移的分子机制。

衔接蛋白Nck1对细胞的形态和运动具有重要作用。我们前期工作中发现Nck1相互作用蛋白Elmo1可能通过与Nck1的相互作用引起细胞骨架改变，促进肝癌细胞的迁移。本研究中，我们构建了组织芯片，对263对肝癌及癌旁组织进行免疫组化检测，发现Elmo1在肝癌组织中表达显著高于癌旁组织，Elmo1高表达的肝癌患者其1、3、5年总生存率和无瘤生存期均显著低于Elmo1低表达患者，Elmo1是肝癌患者预后不良的独立因素。继而我们在肝癌组织和肝癌细胞株SK-Hep-1中证实了肝癌体内、体外均存在有Elmo1和Nck1的相互作用。此外，我们采用免疫共沉淀方法证实肝癌组织较癌旁组织中的Elmo1酪氨酸磷酸化现象更为明显。继而对Elmo1质粒的Y18、Y216、Y395 三个磷酸化位点分别进行点突变，之后将上述质粒分别转染肝癌细胞SK-HEP-1，然后采用GST-Pulldown和免疫印迹对细胞中Elmo1和Nck1的相互作用进行验证，结果提示，上述3个位点对于两者的相互作用来讲都是必须的，突变后作用明显减弱。通过调控Elmo1表达发现，Elmo1能够通过激活Rac1调控肝癌细胞迁移能力；而Elmo1的酪氨酸磷酸化位点如果发生突变则上述功能缺失。此外，我们还证实了Nck1的SH2结构域的完整性对于Elmo1和Nck1相互作用至关重要，也直接影响到Elmo1诱导的Rac1活性增强和细胞迁移能力增强。再者，肝癌组织芯片免疫组化染色结果提示，Elmo1和上皮间质转化（EMT）标记物E-Cadherin和Vimentin及自噬相关标记物Beclin I和p62具有显著的相关性；细胞实验则提示Elmo1能够诱导肝癌细胞发生上皮间质转化，自噬细胞实验仍在进行中。此外，我们已经构建了Elmo1过表达和下调表达的慢病毒载体并获得了稳定表达的肝癌细胞株，正在对上述细胞株进行自噬和EMT芯片检测筛选关键通路蛋白，希望能够对其机制进行深入研究。总之，我们的研究结果显示，Elmo1促进了肝癌细胞的侵袭和转移，Elmo1是肝癌患者肝切除术后预后不良的独立因素，有可能成为肝癌基因治疗的潜在作用靶点。