裂殖壶菌利用木糖发酵的限制性因素解析及代谢工程改造研究

The marine fungal Schizochytrium sp. have received increasing attention as promising cell factory for synthesizing lipid compounds, because it can accumulate up to 200g/L of cell dry weight and 50%-70% of lipid content. As the most abundant renewable resource, lignocellulose has been used to produce a variety of bulk chemicals by microbial fermentation, but it is still in the development stage to convert it into high-value added lipid compounds. Schizochytrium sp. can not grow in media containing xylose as the only carbon source. This project will adopt the strategy of “analysis-construction-enhancement-rational genetic engineering” to develop Schizochytrium sp. strain capable of utilizing xylose efficiently, and then Schizochytrium sp. can be used as cell factory for producing lipid compounds. Firstly, the native key enzymes involving xylose metabolism pathway will be characterized by in vitro expression platform, and the weak or defective expression pathway will be identified. Secondly, the complete and active xylose metabolism pathway will be constructed by genetic engineering in Schizochytrium sp. Thirdly, adaptive evolution will be applied to enhance the xylose consumption efficiency of Schizochytrium sp. Lastly, the comparative genomics and transcriptomics of evolved strains will be investigated to identify and exploit the mechanism of xylose rapid consumption, and then feedback guide the rational genetic engineering. The implementation of this project enable the coupling of lignocellulose treatment and lipid compounds production.

裂殖壶菌是一种海洋真菌，生物量可高达200g/L，油脂含量能达到细胞干重的50%-70%，因此是合成脂质化合物的高效细胞加工厂。作为地球上最丰富的可再生资源，木质纤维素已通过微生物转化实现多种大宗化学品的生产，但是将其转化为附加值更高的脂质化合物却还处于发展阶段。天然的裂殖壶菌并不能利用木糖，本项目采用“解析-构建-强化-理性改造”的策略，旨在赋予其高效利用木糖的能力，为木质纤维素转化为脂质化合物提供底盘细胞。首先借助体外反应考察裂殖壶菌木糖代谢途径关键酶的催化活性，科学判断出木糖代谢的限制性因素；对弱表达或残缺途径展开改造，初步构建出具有代谢活性的木糖途径；随后通过适应性进化技术，强化裂殖壶菌代谢木糖的能力；进一步通过比较基因组学及转录组学，鉴定并挖掘木糖快速发酵表型驯化菌株的突变机制，进而反馈指导裂殖壶菌木糖代谢的理性改造。本项目的实施可实现木质纤维素处理和脂质化合物生产的偶联。

裂殖壶菌是一株具有高产油能力的海洋真菌，其安全性已通过FDA认证。高效的油脂生产能力使其有望成为脂质化合物生产的底盘细胞。一方面，高油脂合成能力表明裂殖壶菌胞内具有丰富的脂质化合物合成前体物质--乙酰CoA。另一方面，油脂可以作为脂溶性化合物的“储存室”，更利于产物的富集其潜力。但是若想进一步拓宽裂殖壶菌的应用，要求其具有广泛的底物谱以及高效的基因组编辑工具。因此本项目主要从裂殖壶菌利用木质纤维素以及挖掘其生产脂质化合物的潜力角度进行研究，以期将裂殖壶菌开发为高效合成脂质化合物的底盘细胞。首先，项目证明了裂殖壶菌不能利用木糖的原因可能是不存在功能活性的木酮糖激酶。通过用不同浓度玉米秸秆水解液为碳源对裂殖壶菌进行补料分批发酵，以及通过抑制物单因素考察，发现裂殖壶菌对酚类化合物的耐受性较低。进一步通过开发两阶段培养策略提高了木质纤维素的利用率；开发了基于农杆菌介导的高效基因组编辑工具，随机整合效率达100%，定点整合效率达30%。通过表达异源的木糖异构酶和木酮糖激酶，获得了能够利用木糖的裂殖壶菌工程菌株。通过过表达乙酰基转移酶，β-胡萝卜素和虾青素的产量分别增加了1.8倍和2.4倍；为了提高裂殖壶菌产油能力，本项目通过考察了添加不同化学调节剂的对裂殖壶菌生长与产油的情况，并通过转录组分析以及代谢组学解析裂殖壶菌面对不同化学调节剂所产生的不同应激反应。结果表明通过添加脂肪酶抑制剂可以有效提高裂殖壶菌的油脂积累能力。总的来说，通过该项目的实施，证明了裂殖壶菌是优良的脂质化合物合成平台，具有良好的工业化应用前景。