耐热酵母K. marxianus利用木糖发酵的限制性因素

耐热酵母K.marxianus利用葡糖糖的乙醇发酵能力与酿酒酵母相当，而在40摄氏度以上的发酵能力比酿酒酵母强得多，被认为是可以替代酿酒酵母用于发酵的潜在菌株，但是利用木糖发酵能力弱。本项目针对耐热酵母K. marxianus利用木糖发酵能力弱的问题，以K. marxianus NBRC1777菌株中的木糖发酵路径为研究对象，在分析木糖代谢中间产物的基础上结合关键酶的性质、关键酶的表达调控研究、利用申请人在此耐热酵母中构建的基因操作体系对这些关键酶的基因进行敲除、外源木糖发酵关键基因的表达等方法，逐步确定影响木糖发酵的限制因素。项目预期将揭示K. marxianus木糖厌氧发酵过程中的限制性因素，为构建在40摄氏度以上木糖、葡萄糖及纤维二糖共发酵的耐热工程酵母打下基础。项目的研究成果对于较高温度下非粮生物质燃料乙醇的同步糖化发酵有重要意义。

本研究对K.marxianus中木糖发酵的限制因素进行了分析，并在获得结果的基础上进行了验证和改造。首先，完成了K.marxianus耐热酵母中木糖代谢中木糖还原酶XR基因（KmXYL1)、木糖醇脱氢酶XDH基因（KmXYL2)、 木酮糖激酶XK基因（KmXYL3)的克隆及基因的敲除，并且成功地对以上基因进行了重组表达和性质测定。发现XR只能利用NADPH为辅酶，但是XDH偏向利用NAD+。尽管与许多报道的酵母有所不同，最终还是在微氧条件下，XR及XDH的辅酶偏好导致了还原力不平衡，使发酵受到抑制。在此基础上将K.marxianus中的XR替换成树干毕赤酵母中的PsXR及其活力大幅提高的N272D突变体。获得的菌株在42°C 乙醇及木糖醇的产量分别提高了12.24和2.77倍，达到了3.55 g /l 和 11.32 g/ l，为此温度下已报道的木糖还原氧化路径发酵的最佳菌株。本研究还构建了木糖异构酶路径的菌株，获得的菌株在42 °C消耗30.15 g/l木糖产生11.52 g/l 乙醇，得率为0.38 g/g, 在45°C仍可利用16.60 g/l木糖产5.21 g/l乙醇，是已报道的较高温度下木糖发酵最好菌株。同时证明改变K.marxianus木糖代谢中对辅酶的利用偏好性的确可以提高该菌对木糖的发酵。在此基础上进一步对K.marxianus进行改造用以进行木糖醇的生产。分别以KMxyl1基因被敲除的菌株和KMxyl1及KmXyl2双敲除的菌株出发，过表达了4份脉孢霉的XR基因。 以KMxyl1敲除的菌株为出发菌株获得的产木糖醇菌株，有完整的木糖代谢路径，该菌株在有氧条件下可以大量积累木糖醇，42°C，能够以180g/l木糖生产132.31 g/l木糖醇，在45°C 仍能够利用75g/l木糖产60.03 g/l木糖醇。采用循环细胞生产策略进行了20轮发酵，该菌在42°C可以利用100g/l木糖生产71.5 g/l 木糖，生产速率达4.43 g/l/h。 而以双敲除菌株为出发菌株的菌株，能够以甘油为辅助底物，高效转化木糖产木糖醇。 在42°C，利用100 g/l木糖，产生100.02 g/l木糖醇。本研究的结果初步揭示了K.marxianus利用木糖发酵的限制因素，对进一步在较高温度下对木质纤维素类生物质中木糖的利用有重要意义。