基于细胞核力学特性与三维基因组的巨噬细胞微重力响应机制研究

Long-term space flight will be a major mission for China National Space Administration. However, microgravity is an issue for astronauts’ health. It has been shown that exposure to space flight result in immune system dysfunction. If this persists during flights, it could be a serious health risk to astronauts and crewmembers participating in lunar or Mars missions. Therefore, understand the mechanism of immune response under microgravity condition is a key topic.. Macrophage is one of the most important immune cells in human body. Its major function is phagocytosis that engulfs a solid particle or pathogen to form an internal compartment known as a phagosome. It has been reported that the biomechanics and immune function of macrophages were changed under microgravity condition. However, how the biomechanics of nucleus and the 3D genome changed under microgravity, still remains unclear.. In this project, we aim at obtaining the biomechanics of nucleus using atomic force microscopy and understand the 3D genome through High-throughput Chromatin conformation capture (Hi-C) technology which uses next-generation sequencing to sequence the whole chromatin and recover its structure information. Therefore, the chromatin structure will provide three-dimensional information on the gene regulation, in a better way to explain how the immune function dysregulated under microgravity. This research is the first one that focuses on nucleus, not only the biomechanics, but also three-dimensional genomic structure and provides the mechanism of immune response under microgravity condition.

失重环境下免疫细胞的损伤机制一直是空间生物学关注的重点问题之一。巨噬细胞在人体免疫过程中发挥重要作用。有文献指出，在空间失重环境下，巨噬细胞的形态以及细胞的力学特性（如细胞粘附力，迁移力等）均发生明显变化。然而，有关巨噬细胞核的力学性质以及细胞核内染色质（基因组）的三维结构是如何响应失重这一力学环境，包括基因组的三维结构是如何指导基因在特定空间和时间表达等机理，则少有研究涉及。“结构决定功能”是自然界规律的共识，最新的染色质构象捕获技术已经表明很多基因在线性基因组序列上虽然距离很远,但在空间结构上距离很接近。.因此，本项目拟从空间失重角度，以巨噬细胞为模型，通过原子力显微镜观测细胞核力学性质变化以及运用生物信息学中高通量染色质构象捕获技术，研究巨噬细胞的细胞核变化与免疫功能的关系，从细胞核力学性质与基因组的多维角度阐明空间失重环境下免疫细胞响应机制，为实时观测航天员的免疫反应提供理论依据。

失重环境下免疫细胞的损伤机制一直是空间生物学关注的重点问题之一。巨噬细胞在人体免疫过程中发挥重要作用。有文献指出，在空间失重环境下，巨噬细胞的形态以及细胞的力学特性均发生明显变化。然而，有关巨噬细胞核的力学性质以及细胞核内染色质结构是如何响应失重这一力学环境，包括基因组的结构是如何指导基因在特定空间和时间表达等机理，则少有研究涉及。因此，在“结构决定功能”的共识下，研究巨噬细胞在失重条件下细胞核力学性质以及染色质的三维结构，有助于更好的阐明巨噬细胞免疫功能相关分子的表达和调控，在生物力学领域有重要意义。.本实验使用小鼠巨噬细胞系RAW264.7，通过随机回转仪模拟失重处理8小时，对照组与实验组各设置三个重复。分别提取细胞DNA和mRNA，进行染色质开放区测序（ATAC-seq）和转录组测序（RNA-seq），生物信息学分析包括数据质量评估，参考基因组比对，差异峰分析，差异表达基因分析以及多组学的联合分析，并对其关联基因进行功能注释与通路分析。选取显著通路的差异表达基因，进行qPCR分子生物学验证。.本实验使用原子力显微镜测量细胞及细胞核杨氏模量，发现模拟失重后细胞和细胞核的杨氏模量均显著性降低，说明模拟失重对细胞以及细胞核产生影响。通过ATAC-seq测序，识别开放染色质区域，捕获调控序列的信息，获得138.24 Gb数据，Q30碱基百分比达到85%以上，与参考基因组的比对率平均96%。通过峰提取，选取FDR<0.05 的作为识别出的峰，对照组与失重组比较，获得差异峰6651个（增强3185个，减弱3466个）。通过RNA-seq测序，获得49.43Gb数据，差异表达基因336个（上调226，下调110）。通过ATAC-seq与RNA-seq的多组学关联分析，获得57个差异基因，集中在细胞因子，细胞周期，免疫响应，MAPK激酶等相关通路。选取显著通路相关基因，通过qPCR验证，初步获得基因表达变化规律。本研究发现短时失重处理可以引起细胞应激通路相关的基因上调，进而调节其免疫功能，为巨噬细胞微重力免疫响应提供理论基础。