脂肪肝缺血再灌注损伤中calpain 2对自噬的调控作用及机制研究

正常肝细胞缺血再灌注（I/R）时calpain 2高表达，自噬受到抑制，引起I/R损伤。脂肪肝组成型高表达calpain 2，自噬水平较低，且脂肪肝I/R损伤较正常肝更严重。但自噬及calpain 2在脂肪肝I/R损伤的作用尚不清楚。我们推测脂肪肝组成型高表达的calpain 2在I/R时负向调控自噬，从而介导了更严重的I/R损伤。为证实上述假设，本课题将首先证实自噬水平降低是导致脂肪肝I/R损伤较正常肝更严重的原因。进而研究calpain 2能否下调脂肪肝自噬水平而加重其I/R损伤，并探讨calpain 2调控自噬的分子机制。最后在脂肪肝移植模型中，证实calpain 2抑制剂处理对移植后脂肪肝I/R损伤具有保护作用。本课题旨在证实calpain 2下调自噬从而介导了脂肪肝I/R损伤，课题的实施将加深我们对脂肪肝I/R损伤机制的理解，并为临床上减轻脂肪供肝移植后I/R损伤提供新的方法。

供肝脂肪变性可导致移植预后不良甚至受者死亡。脂肪肝对缺血再灌注损伤更敏感的原因目前尚不清楚，同时临床上缺乏相应有效的治疗措施。目前已知自噬在肝缺血再灌注损伤中起重要保护作用，但在脂肪肝中作用不明。本课题回顾性分析23例复流后的公民器官捐献脂肪肝供肝标本，及23例正常对照供肝标本，观察自噬标记物与移植预后的关系。进一步在脂肪肝小鼠缺血再灌注模型中，研究钙蛋白酶calpain 2对自噬的调控作用及机制。我们研究发现：免疫组化结果提示自噬标记物Beclin-1和LC3在脂肪肝供肝中低表达，表达水平与脂肪变性程度呈显著负相关，低表达Beclin-1和LC3与肝移植预后不良显著相关。在小鼠缺血再灌注模型中，我们发现再灌注后脂肪肝细胞自噬水平低下，共聚焦显微镜下可观察到自噬流显著受损。进一步蛋白筛查实验发现，以自噬相关蛋白Atg3及Atg7下调尤为明显。同时我们发现脂肪肝细胞高表达calpian 2并在再灌注后强烈活化。经体外实验证实，活化的calpian 2可切割Atg3（切割位点位于Δ92-97）及Atg7（切割位点位于Δ344-349）。最后，我在体内及体外均证实了过表达Atg3或Atg7，可显著缓解脂肪肝缺血再灌注损伤。抑制或干扰下调calpain 2同样可显著缓解脂肪肝缺血再灌注损伤。因此，Calpain 2介导的Atg3及Atg7蛋白降解，是脂肪肝对缺血再灌注损伤更敏感的原因之一。通过各种手段提高细胞自噬有望缓解脂肪肝缺血再灌注损伤，进而扩大供肝池。