产丁醇梭菌耐受高浓度丁醇的生理及代谢调节机制研究

As a great potential biofuel, acetone, butanol and ethanol (ABE) fermentation by clostridial species has regained much attention in both industrial and academic worlds recently. However, butanol toxicity to the current producing microorganisms limits its accumulation in the fermentation broth, and for this reason the biobutanol production processes is of low yield, productivity and conversion efficiency. Therefore, this presents a key scientific challenge in ABE fermentation process. We propose to use an effective mutation screening method to obtain high butanol tolerance strain. The expression of different proteins and the corresponding changes of gene at the transcription level will be identified under high butanol concentration conditions between wild-type strain and mutant strain by metaproteomics and transcriptomics. Metabolic flux changes and enzyme levels will also be investigated under the same conditions by metabolic flux analysis. Furthermore, we will study the changes of cell morphology, cellular microenvironment and membrane lipid under high butanol concentration stress between the wild-type strain and mutant strain. After successful completion, the mechanisms of physiological and metabolic regulation will be fully revealed and understood in mutant strain. In addition, our results will provide the theoretical foundation and technical support to further enhance butanol production by clostridial, and improve the industrial adaptability and capabilities of this microorganism, thus providing scientific know-how of solvent tolerance mechanisms.

作为一种极具潜力的生物燃料，生物丁醇已经成为世界能源领域的研究热点。然而，丁醇对细胞的毒害作用导致其产量、生产强度和底物转化率较低是目前丙酮丁醇发酵过程中存在的一个关键科学问题。本项目拟采用诱变新技术及结合可视化筛选模型获得高丁醇耐受菌；通过宏蛋白质组学和转录组学技术，找出原始菌与突变菌在高浓度丁醇胁迫下差异表达蛋白及其编码基因在转录水平上的变化；采用代谢通量分析技术，分析同一条件下原始菌与突变菌代谢通量及代谢途径酶含量变化；以及系统分析突变菌与原始菌在高浓度丁醇胁迫下细胞形态、细胞内微环境及细胞膜脂变化等。从多层次、多角度获得突变菌在高浓度丁醇胁迫下发生变化的信息组，以期较为全面的揭示产丁醇梭菌耐受高浓度丁醇的生理及代谢调节机制，为提高产丁醇梭菌合成丁醇能力提供理论指导与技术支持。本研究结果将为提高该微生物的工业适应性和其它微生物耐受有机溶剂机理提供科学的探索。

丁醇是一种重要的基础平台化合物，同时还是一种极具潜力的新型生物燃料，然而丁醇发酵过程中原料成本过高以及丁醇对细胞的毒害作用导致其生产强度较低是目前丙酮丁醇发酵过程中亟待解决的关键科学问题。.本项目首先通过创新筛选方法获得了多株高丁醇耐受性、高丁醇产量菌株；通过对发酵原料的选优，获得了多种非粮丙酮丁醇发酵原料，并通过工艺优化提高丁醇生产强度；从细胞膜表面疏水性及细胞膜脂肪组成等角度阐释菌株耐受高浓度丁醇机制。具体研究内容如下：.1、通过自行设计的“三明治”筛选方法，并结合多因子复合筛选模型获得了多株丁醇产生菌.采用“三明治”筛选方法从大庆油田等地收集的样品中分离出220多株丁醇生产菌，其中PW12、L175及a914丁醇产量较高，经16S rDNA鉴定为C. acetobutylicum PW12、C. beijerinckii L175和C. beijerinckii a914。经常压室温等离子体、连续富集方式等手段最终获得较高丁醇耐受性及较高丁醇产量菌株：ART18、SE25、SE36，其中SE25可耐受30 g/L的丁醇冲击，在以P2为培养基时，丁醇及总溶剂的产量分别达到13.04 ± 0.66 g/L和18.13 ± 0.84 g/L。.2、探索到较优的发酵原料及影响丁醇生产强度的关键控制工艺.以课题组选育的丁醇产生菌SE25、SE36、ART18等为生产菌，以木薯粉、葡萄糖、葛渣等为发酵原料，发现在发酵过程中添加脂肪酸、金属离子、分阶段调节发酵液pH以及通过纤维床固定化发酵等手段能提高丁醇的生产强度及对淀粉的转化率，最高的丁醇生产强度及对淀粉的转化率分别达到0.63 g/L/h和0.36 g/g。.3、从细胞膜表面疏水性及细胞膜脂肪组成等角度阐释菌株耐受丁醇机制.（1）高溶剂耐受菌SE25通过生成荚膜来提高细胞耐受不良环境（如有机溶剂）的能力。.（2）细胞表面的疏水性影响其耐受有机溶剂的能力，当细胞的表面疏水性提高时，其抵抗有机溶剂（丁醇）的能力下降。.（3）高溶剂耐受菌SE25在丁醇冲击下细胞膜保存较完整，在2.5 %丁醇冲击下，膜电位仅下降9.8 %。.（4）高溶剂耐受菌SE25通过提高细胞膜中饱和脂肪酸含量，提高其细胞膜的刚性来适应丁醇的冲击。