短链脱氢酶底物识别的分子基础及其立体选择性形成机制研究

Asymmetric reduction of prochiral ketones by alcohol dehydrogenase has become the first choice for the synthesis of high value-added chiral alcohols in biocatalysis. It is of great importance to discover the alcohol dehydrogenase with certain substrate specificity effectively from the vast genetic resources and to accurately realize the artificial design of the substrate adaptability and stereoselectivity, for the purpose of solving the problem for the limited source of enzyme, poor substrate scope and unsatisfied stereoselectivity. Based on this, this project is aimed to the key scientific problem of "molecular basis of the interaction between the short-chain dehydrogenase and its substrate, and how the stereoselectivity of this process is formed." By using molecular docking, molecular dynamics simulation and QM/MM calculation, the binding mode between enzyme and different substrates, reaction transition state and the intermediate structure and proton transfer pathway will be analyzed. We will finally reveal the molecular basis of the substrate recognition and the mechanism of stereoselectivity, through the combination of dynamically conformational analysis of the molecular mechanism for the key amino acids and domain and the influence of substrate properties on the activity and selectivity. At the same time, we hope to improve the efficient use of short-chain dehydrogenase by the establishment of specific mining strategy based upon the amino acid sequence; By rational design combined with virtual mutation, we hope to achieve the development of high-valued function for the short-chain dehydrogenase.

醇脱氢酶不对称还原前手性酮已成为生物催化领域合成高附加值手性醇的首选途径。面对浩瀚的基因资源库，如何高效的挖掘针对靶向底物的特异性短链（醇）脱氢酶，以及如何精准的实现其底物适应性及立体选择性的人工定制，对解决酶来源有限，适用底物范围小，立体选择性不理想等问题具有重要的研究意义。基于此，本项目拟从“短链脱氢酶与底物相互作用的分子基础，以及该过程中立体选择性是如何形成的”这一关键科学问题出发，采用分子对接，分子动力学模拟，QM/MM计算等手段，分析酶与不同底物之间的结合模式，反应过渡态及中间体结构，质子传递路径等重要反应历程，通过动态的构象分析解析关键氨基酸及结构域的作用机制，结合底物性质对酶活及选择性的影响规律，最终阐明酶底物识别及立体选择性的分子基础。同时建立基于氨基酸序列的特异性挖掘策略，提高短链脱氢酶资源的高效利用；结合虚拟突变进行理性设计，最终实现短链脱氢酶一酶多用的深度开发。

手性醇作为一种重要的手性砌块及平台化合物，广泛的用于手性药物及其他手性精细化学品的合成。短链醇脱氢酶不对称还原前手性羰基化合物制备手性醇，由于其具有高度的化学、区域和立体选择性，已成为生物催化领域手性醇合成的首选途径。为解决酶来源有限，适用底物范围小，立体选择性不理想等实际问题，本研究利用分子对接、分子动力学模拟等手段，通过对一系列影响酶催化活性及立体选择性的关键因素进行分析并总结规律，对短链脱氢酶立体选择性形成及酶与不同底物结合模式的分子机制进行了深入的解析和阐述。通过基因探矿技术，结合宏基因组对特定环境微生物资源的挖掘，共构建了300多个不同来源不同性质的短链脱氢酶，形成一个能够催化多类型底物，且具有互补立体选择性的短链脱氢酶酶库，为手性醇的酶法合成提供了广泛而又多样的候选酶资源库。针对手性醇在重要医药中间体中的应用，开发并建立了一系列重要手性砌块的酶法合成工艺，底物浓度和产物光学纯度均达到工业化应用的要求。在此过程中，针对短链脱氢酶催化特性及辅酶循环开发了高效的的催化反应系统，为短链脱氢酶在手性醇合成中的工业应用打下了坚实的基础。结合对短链脱氢酶立体选择性形成及酶与不同底物结合模式的分子机制的深入研究，建立了短链脱氢酶立体选择性、催化活性及底物耐受性的理性改造方法学，实现了短链脱氢酶一酶多用的深度开发。同时也开发了基于氨基酸一级序列的特异性挖掘策略，成功用于高耐受性氨基酸脱氢酶的挖掘和应用，将该方法学拓展到其他酶类，为实现对浩瀚基因资源库的精准挖掘奠定了基础。