番茄无致病力青枯菌的遗传稳定性及其分子机制

Bacterial wilt of tomato caused by Ralstonia solanacearum is a world-widely serious disease. Using an avirulent strain of R. solanacearum with genetic stability to produce ‘plant vaccine’ is a novel approach to control the disease. In our previous study, the avirulent strains of R. solanacearum could be divided into different purity-degrees with high performance ion-exchange chromatography method. The higher purity-degree was, the avirulent strain had higher control efficiency against tomato bacterial wilt disease. Based on the results, this project is going to study genetic stability of tomato high-pure avirulent R. solanacearum and its molecular mechanism. Firstly, high performance ion-exchange chromatography technology will be used to identify high-pure avirulent strains. Then, the genetic stability of high-pure avirulent strains will be systematically studied, from multiple aspects of colony morphology, strain purity, content of extracellular polysaccharide (EPS I), swimming and swarming ability and control efficiency against the disease, etc. Furthermore, whole genome re-sequencing technique will be subsequently employed to compare difference of functional gene regions between the stable and unstable high-pure avirulent strains. The insertion, loss and variation of gene will be analyzed to reveal the molecular genetic mechanism for genetic stability of high-pure avirulent strain. The study aims to establish a set of identification technology and analysis platform for the genetic stability, and elucidate molecular mechanism for genetic stability of high-pure avirulent strain. This project will lay a solid theoretical foundation for development and utilization of plant vaccine.

番茄青枯病是世界性的重大病害，获得遗传稳定的青枯菌无致病力菌株，是研发青枯病植物疫苗和防治该病害的一种新途径。申请人已利用高效离子交换色谱检测出青枯菌无致病力菌株具有不同的纯度，纯度高的菌株生防效果好。本项目拟在此基础上，开展番茄高纯度无致病力青枯菌的遗传稳定性及其分子机制研究。采用高效离子交换色谱进行高纯度无致病力菌株鉴别；从菌落形态、菌株纯度、胞外多糖含量、运动能力及病害防效测定等多角度，对高纯度无致病力菌株传代过程的遗传稳定性进行系统研究；通过全基因组测序，比较分析遗传稳定和不稳定菌株之间功能基因区域的插入、丢失和变异等，揭示其稳定或变异产生的分子遗传学机制。本研究将建立一套高纯度无致病力青枯菌遗传稳定性的鉴定技术与分析平台，阐明其遗传稳定的分子机制，为番茄青枯病植物疫苗的开发应用奠定理论基础。

获得遗传稳定的青枯菌无致病力菌株，是研发青枯病植物疫苗和防治该病害的一种新途径。本研究利用已构建的青枯菌致病力判别指标“弱化指数（AI）”对163株不同来源青枯菌突变菌株进行致病力划分，分为无致病力（AI介于0.75~0.93）、过渡型（AI介于0.66~0.73）和强致病力（AI介于0.49~0.64）菌株。进而采用高效离子交换色谱（HPIEC）对不同致病力菌株进行色谱行为分析，可分离出3个特征峰：P1、P2和P3，分别是无致病力、过渡型和强致病力菌株的特征峰，并构建色谱效价指数（CTIi）作为青枯菌纯度判别指标，CTIi=Si/（S1+S2+S3）×100%（i=1、2或3；S1、S2和S3分别对应P1、P2和P3的峰面积），CTIi值100%为高纯度菌株，0＜CTIi＜100%为混杂菌株，即致病力分化菌株。将不同致病力青枯菌连续传代50次后，比较分析F50和F1菌株在菌落和菌体形态、生理生化特性、致病力、致病相关因子及防效的异质性，分析不同致病力青枯菌连续传代中的遗传稳定性，结果表明，强致病力菌株传代10次后致病力减弱，至20次后为无致病力菌株，过渡型菌株传代50次后致病力也比F1减弱；无致病力菌株连续传代致病力保持稳定，其中无致力菌株FJAT-1458和FJAT-1463在所有检测指标中均能保持稳定性。对36株不同致病力及传代数青枯菌进行全基因组测序，比较基因组分析青枯菌基因间易位、倒置、单核苷酸突变、插入与缺失等。荧光定量法分析青枯菌致病相关基因xps、egl、eps和phcA在不同致病力及传代数菌株中表达量的异质性，结果表明，致病相关基因的表达量在无致病力菌株不同传代数中基本没有明显变化，在强致病力和过渡型菌株传代10次开始显著降代，传代20次后致病相关基因的表达量趋于稳定。此外，比较基因组发现，无致病力菌株FJAT1458有1个T6SS分泌蛋白（SPVI）在强致病力菌株FJAT91中缺失，而FJAT91有1个毒素相关基因（TOXIN）在FJAT1458中缺失，通过基因敲除技术验证了这两个基因与致病力相关。本研究共发表论文12篇，其中SCI源论文7篇；培养研究生2名；获授权国家发明专利1个；获颁布福建省地方标准1项。