被毛特异表达蜘蛛拖丝蛋白基因Spidroinl克隆绵羊的研究

In order to establish transgenic sheep with the gene of spider dragline silk protein in hair follicle by nuclear transplantation, we constructed an eukaryotic expression vector KAP6.1-pIRES-EGFP-4S by linking the tetra-polymerized gene of spider dragline protein silk to sheep keratin gene promoter KAP6.1 in previous work. Sheep fibroblasts were transfected with the plasmid, and the transgenic cell line was established. Reconstructed embryos after somatic cell nuclear transfer could produce blastula. In this research, eukaryotic expression vector pcDNA3.1-KAP6.1-4S would be constructed from the 4S gene and KAP6.1.Transgenic cells would be obtained using the above-mentioned method. These two kinds of cells would be used in somatic cell nuclear transfer and embryo transplantion,and the transgenic cloned sheep would be produced. For the transgenic sheep,gene integration, expression position of the object and report gene, translation of purpose protein would be tested by molecular methods. Stucture and capability of transgenic sheep wool would be detected by electron microscope and mechanic techniques.This research might lay the foundation for the transgenic animal with expression of spider dragline silk protein in hair follicle.

为了建立通过绵羊被毛获取蜘蛛拖丝的方法，前期工作中，已利用蜘蛛拖丝蛋白基因Spidroin1的4聚体（4S）和绵羊角蛋白结合蛋白启动子KAP6.1，构建了带有GFP 的真核表达载体KAP6.1-pIRES-EGFP-4S，并转染绵羊成纤维细胞后筛选获得转基因阳性细胞株；利用该细胞经体细胞核移植获得的重构胚具有在体外发育至囊胚的能力。本研究拟利用4S和KAP6.1，构建无GFP的真核表达载体pcDNA3.1-KAP6.1-4S，同样经转染和筛选获得转基因阳性细胞；利用上述的2种转基因细胞，采用体细胞核移植和胚胎移植等程序，获得转基因绵羊。采用分子生物学方法，检测转基因绵羊的目的基因整合、目的基因和报告基因的表达部位及表达量、目的蛋白的翻译等情况；采用常规、电子显微镜和力学等方法，检测转基因绵羊被毛微细结构和性能，为最终培育被毛特异表达蜘蛛拖丝蛋白基因的转基因绵奠定坚实基础。

为了利用前期工作中获得的蜘蛛拖丝蛋白基因Spidroin1 的4聚体（4S）和绵羊角蛋白结合蛋白启动子KAP6.1，构建的带有GFP 的真核表达载体KAP6.1-pIRESEGFP-4S获得被毛中特异表达蜘蛛拖丝蛋白基因的转基因绵羊，本研究根据申请本项目过程中专家们的提出的建立，主要开展了转蜘蛛拖丝蛋白基因小鼠和体细胞克隆绵羊制备的相关研究。为了获得转蜘蛛拖丝蛋白基因小鼠，利用带有蜘蛛拖丝蛋白基因Spidroin1四聚体（4S）的pcDNA3.1-4S和pIRES2-EGFP构建能够在全身表达的pIRES2-EGFP-4S载体，对其线性化后，采用原核注射方法获得转基因小鼠，其结果，原核注射胚的卵裂率达94.4%，2细胞期胚胎发育至囊胚的比率为60.4%，其中约有50%的囊胚在蓝光激发下发出绿色荧光。目前正在开展胚胎移植实验，有望在短期内获得转基因小鼠；本研究中，利用体细胞核移植的方法获得原核期胚胎，采用手术输卵管移植方法进行输卵管移植，其结果，移植受体的52只中有2只受体妊娠，其中1只移植受体发生流产，另一只生1只生产健康、性别和体型与共核幼羊一致的的幼羊。此外，为了后期获得不含报告基因GFP的转蜘蛛拖丝蛋白基因绵羊，在构建K6.1-2S-pcDNA3.1载体的基础上，建立了相应的转基因绵羊成纤维细胞系。上述结果为最终生产在被毛中特异表达蜘蛛丝蛋白的绵羊新品系奠定坚实基础。完成本项目期间，发表相关论文1 篇，余下结果目前进入撰写论文和投稿阶段。此外，共培养2名博士生和4名硕士生，其中博士生和硕士生各1人已通过答辩获得相应学位。