一种蛋白酶抑制剂抑制猪A型流感病毒复制的机制

由于流感病毒变异频繁，疫苗研制存在滞后等问题，抗流感药物仍是预防流感的重要手段。我国目前尚无具有自主知识产权的抗流感病毒药物，高致病性禽流感威胁仍然存在，研发新的抗流感病毒药物迫在眉睫。在前期研究中，我们在国内外首次发现某一种蛋白酶抑制剂能够显著抑制A型流感病毒的复制，其机制可能与病毒核糖核蛋白复合体（vRNPs）的核输出受到抑制有关。由于猪流感病毒不仅危害畜牧业生产，而且具有重要公共卫生学意义，加之生物安全防护要求低，可操作性高，所以本项目拟以猪A型流感病毒为研究对象，分析该蛋白酶抑制剂对病毒vRNPs相关基因的转录、vRNPs相关蛋白的合成、vRNPs的组装、vRNPs依赖的CRM1核输出途径等方面的影响，弄清该蛋白酶抑制剂抑制流感病毒复制的分子机制，并在试验感染猪上观察该蛋白酶抑制剂的抗病毒作用，以期为人用抗流感病毒药物研制提供分子靶点，为兽用抗流感病毒中药筛选提供理论支持。

本课题的研究目标是弄清某蛋白酶抑制剂抑制猪A型流感病毒的vRNPs核输出的分子机制，并初步分析该蛋白酶抑制剂作为抗流感病毒药物的可能性。通过3年的实施，完成了如下研究内容。.（1）抗体制备：克隆了H3N2流感毒株的PB1、PB2、PA、NP、M1、NS2、M2基因，构建了原核表达载体，表达并纯化了重组蛋白，免疫动物制备了抗体。采用western blot和免疫荧光等技术分析了制备抗体的特异性，并对病毒蛋白的表达时相进行了分析，获得了病毒感染过程中主要蛋白的表达时相。.（2）细胞泛素化分析：由于蛋白酶抑制剂能够调控细胞泛素系统，我们分析了病毒感染后细胞泛素化的水平，发现了病毒感染能够提高细胞整体泛素化的水平。但是，具有抗病毒作用的p53泛素化水平明显下降，进一步研究发现病毒NP具有抑制p53泛素化作用，激活了p53，而病毒蛋白NS1具有抑制p53活性的作用。.（3）蛋白酶抑制剂抑制vRNPs核输出机制：蛋白酶抑制剂处理病毒感染细胞，发现了蛋白酶抑制剂能够抑制病毒复制、基因转录、蛋白质合成以及vRNPs的核输出。进一步研究发现蛋白酶抑制剂抑制病毒NP、NS1、M1基因的表达和蛋白合成，造成vRNPs不能正常组装，影响了vRNPs的核输出，阐明了蛋白酶抑制剂抑制病毒vRNPs的核输出及其复制的机制。.（4）泛素化系统在病毒复制中的作用分析：使用泛素连接酶E1抑制剂处理病毒感染细胞，发现了E1抑制剂能够抑制病毒复制，表明泛素化系统在病毒复制中发挥重要的作用。.（5）动物实验：病毒感染动物后用蛋白酶抑制剂进行治疗，发现蛋白酶抑制剂能降低感染动物肺组织中病毒滴度，减轻肺部炎症，延长了病毒感染小鼠的平均存活时间，降低死亡率，保护率达60%。 .（6）中药单体抗流感作用分析：筛选了多种与蛋白酶抑制剂结构类似的中药单体，分析了在动物体内抗流感病毒作用。发现中药单体CU和QU对攻毒后动物保护率能达到100%，MY、Sh和Ge的保护率为80%，KA的保护率为70%，显示了这些中药单体具有潜在治疗价值。.（7）发表SCI论文4篇，其中影响因子5分以上1篇，4分以上2篇，2分以上1篇。申报专利2，培养博士研究生1名，硕士研究生2名。.课题阐明了蛋白酶抑制剂抑制猪流感病毒vRNPs的核输出及其复制的机制，并获得了具有潜在治疗价值的抗流感病毒中药单体，完成了任务书所有的研究内容和考核指标。