弱光非线性结构光照明超分辨成像研究

Structured-illumination microscopy (SIM) is one of the most promising super-resolution imaging devices in life sciences. Previously, linear SIM has achieved ~100nm resolution under visible light-wave illumination with greater resolution extension possible if appropriate nonlinear fluorescence phenomena are introduced, then an implementation of nonlinear structured-illumination microscopy (NL-SIM) can be generated that is of theoretically unlimited resolution. Unfortunately, in their most basic form (i.e., under conditions of saturated nonlinearity), NL-SIM methods require extreme peak intensities from the incident laser―on the order of MW/cm^2 , and to our knowledge there have been no published results of fast super resolution NL-SIM methods under ultralow light intensity with ultra-short exposure time. This project proposes a novel method to implement weak-light nonlinear structured-illumination microscopy (WNL-SIM). By exploring unique super-resolution imaging mechanism with both activating fields and exciting fields are sinusoidal structured, as well as new approaches to generate maximal contrast optical structured fields, it will reveal bio-samples at 50nm resolution using light intensities on the order of 10W/cm^2 that is five orders of magnitude lower than those needed for saturation NL-SIM. This project will achieve original innovation in basic bio-imaging research and a biologically compatible super-resolution imaging method for biology and fundamental medicine study.

结构光照明荧光显微镜（SIM）是最具应用前景的超分辨成像设备之一，能够在可见光照明条件下，达到100nm横向分辨率，并且通过进一步引入非线性光学效应，开发非线性SIM技术，理论上可实现无限高分辨率完美成像。但是目前非线性SIM技术依赖于高功率照明光场，还没有合适的方法可以兼顾低光照功率、短光照时间、高成像分辨率，这极大地限制了非线性SIM技术在生物医学领域的应用。本项目研究弱光非线性结构光照明超分辨成像方法，创新性地提出低功率结构光激活―结构光激发的新型成像机制，并引入先进的光场调控方式以及使用新型高性能开关蛋白作为荧光探针，能够在弱光照明条件下(峰值功率比目前饱和非线性SIM技术低5个量级)，实现50nm横向分辨率快速超分辨显微成像。本项目的实施可在超分辨成像基础理论研究中取得原始创新成果，并为生物学和医学前沿课题研究提供先进的实验技术。

光学超分辨成像方法是生命科学领域的研究热点，通过超分辨成像可实现在分子-细胞-组织-活体等不同层次上实时、动态地“看”到活细胞的相互作用，这已成为产生重大前沿科研成果的突破口。然而，根据阿贝衍射理论，普通光学显微镜的横向分辨率极限约为200nm，无法观察小于波长特征尺度的生物结构。随机光学重建显微术(STORM/PALM)和受激辐射耗损显微术(STED)虽然能够实现小于50nm的成像分辨率,但需要使用高功率密度激光，对生物样品，特别是活细胞样品具有较强的光损伤和光漂白效应，这限制了它们在活细胞长时间动态观测中的应用。线性结构光照明成像方法(SIM),成像速度快，光功率密度低，是理想的活细胞高分辨观测方法，但传统线性SIM分辨率仅能达到120nm左右。.针对生命科学前沿研究对低光照、超高分辨成像能力的巨大需求，以及现有技术方法难以克服的问题，本项目研究建立一种弱光非线性结构光照明超分辨成像方法和系统。创新性地提出结构光激活+结构光激发的两步结构光照明的成像方式，在低光功率密度条件下实现等效二阶非线性效应,把SIM成像分辨率提高1倍。采用铁电液晶空间光调制器替代机械光栅，能够灵活生成任意形式的结构光场；开发基于FPGA的并行同步控制系统，实现了更快的成像速度，并可以通过编程使系统工作在不通的成像模式；开发了能够适用于弱信号样品的SIM/NL-SIM超分辨图像重建算法和软件，通过优化算法原理和图像处理方法，使得对低信噪比原始图像的处理能力大幅提高。利用该设备对荧光微球、细胞内质网、线粒体、细胞核以及细胞骨架等生物样品进行观测，实现了线性SIM模式下100nm横向分辨率，非线性SIM模式下62nm横向分辨率。在完成成像方法和系统原理验证的基础上，进一步开展光机系统工程化、软件工程化研究，积极开展成果转化。本项目研制的弱光非线性结构光照明超分辨成像方法和系统的整体性能指标达到国际先进水平。