基于等离子体显微成像的外泌体单颗粒动态分析技术的研究

Exosome analysis is the most promising technology for cancer diagnosis and therapy. However, fundamental mechanism study and clinical application of exosomes has been greatly hindered, due to the lack of analytical technique with the capability to rapidly and accurately characterize the physical and biochemical properties of exosome. Here, we propose to develop an imaging technique for single exosome dynamic analysis, based on the high resolution plasmonic microscopy (HRPM). The proposed technique will be useful for quantitatively characterizing multiple physical and biochemical properties of exosome, and for studying the dynamics of functional processes involving exosomes. The project will be focused on the following topics. 1) Set up and optimize of the optics and algorithms in the HRPM system to realize label free single exosome imaging. 2) Establish the methodology for determining the size distribution and concentration of exosome samples with the HRPM. 3) Monitor and determine the kinetics of interaction between single exosome and antibodies with HRPM. The key innovation of the proposed technique lies in 1) label free imaging of single exosome particle (detection limit lower than 30 nm), 2) simultaneous determination of the size, concentration and protein biomarkers of exosomes, 3) dynamic recording of the functional process of single exosome. The successful completion of the project will provide a unique and powerful tool for the fundamental study and clinical application of exosomes.

外泌体分析是最具前景的癌症诊断和治疗技术，但由于缺少足够灵敏和快速的综合检测平台，外泌体的机理研究和临床分析应用目前还十分困难。本课题拟开发一种基于高分辨率等离子体显微成像（HRPM）的外泌体单颗粒动态分析技术，用于外泌体多种物化参数的定量标测，以及外泌体的生理功能过程研究。其核心内容包括：1）HRPM系统的光路及算法建立和优化，实现外泌体单颗粒的无标记成像检测；2）HRPM检测外泌体的粒径分布和浓度的方法建立；3）外泌体与抗体相互作用的动力学研究。该技术的创新性在于：1）外泌体单颗粒免标记光学成像检测（检测限优于30纳米）；2）同时检测外泌体样本的粒径、浓度和蛋白分子标记物等多种物化参数；3）外泌体与抗体相互作用的动态分析。本课题的顺利完成将为外泌体的检测和分析提供一种全新高效的技术手段。

外泌体是最具前景的液体活检疾病诊断生物标志物之一。由于外泌体的尺寸微小，已有技术难以在单颗粒尺度进行分析，缺乏个体间的重要异质性信息。因此，本课题开发了一种基于干涉型表面等离子体显微成像系统（iPM）的外泌体单颗粒动态分析技术，围绕成像系统构建及算法开发、单颗粒成像性能验证与优化以及外泌体多参数分析方法建立等方面开展研究，取得了以下重要研究成果：1）将iPM系统成像灵敏度提高了1个数量级，实现了外泌体单颗粒的免标记直接成像，成像灵敏度覆盖外泌体的全粒径范围（30-150nm）；2）发展了对外泌体粒径分布、浓度和蛋白分子标志物等多种物化参数的定量检测方法，粒径检测分辨率达10nm，浓度检测范围为10^8~10^10/mL，其优势在于可以分析特定亚型的外泌体个体，提高检测特异性；3）实现了对外泌体与抗体分子间相互作用动力学参数的检测，其优势在于可以对不同粒径外泌体进行差异化检测，获得不同亚型外泌体的动力学信息；4）探索了基于该外泌体单颗粒分析技术的新型肿瘤诊断技术，外泌体亚型分析的初步结果证明该技术能将肿瘤分型的精度从34%极大提升至80%以上。基于以上成果，在ACS Nano和Analytical Chemistry上发表论文共4篇，申请发明专利1项。综上所述，该项目研究已顺利完成，为外泌体的基础研究提供了新的技术平台，突破了传统外泌体分析技术缺乏个体间差异性信息的瓶颈问题，同时为基于外泌体的肿瘤诊断提供了潜在的新技术。