广藿香中百秋李醇的动态积累模式及分子调控机制

Patchouli alcohol, one of the active constituents of Pogostemon cablin (Blanco) Benth., has been the index component for evaluating patchouli medicinal materials and patchouli oil quality in all of China Pharmacopoeia. Patchouli alcohol has widely been used in pharmaceuticals, food and cosmetics, which gives rise to an increasing demand. It was reported that the content of patchouli alcohol was very little, which limited the large-scale production and development and utilization of P. cablin and patchouli alcohol. Therefore, it is necessary to study the biosynthesis and accumulation rules of patchouli alcohol. This project will isolate patchouli alcohol synthase gene from P. cablin by using molecular biology and bioinformatics technology and verify the function in prokaryotic expression system. To study the molecular biology mechanisms of patchouli alcohol synthesis, GC-MS method will be used to determine the dynamic accumulation mode and tissue distribution pattern of patchouli alcohol in different P. cablin samples, Q-PCR and Western-blot methods will also be used for detecting the mRNA and protein level of this enzyme. The relationships of patchouli alcohol content and transcriptional or post-transcriptional level of patchouli alcohol synthase will be analyzed with different treatments by metal ions and circadian rhythm to reveal the metabolic regulation mechanism and control level. This will provide theoretical foundation and technical support to improve patchouli alcohol content in P. cablin.

百秋李醇作为广藿香的活性成分之一，是历版《中国药典》规定的用于评价广藿香药材及广藿香油质量的指标成分，广泛应用于药品、食品及日用化妆品行业，需求量与日俱增。由于广藿香中百秋李醇含量低，限制了广藿香、百秋李醇的规模化生产和开发利用，因而有必要对百秋李醇的生物合成与积累规律展开研究。本项目利用分子生物学和生物信息学技术克隆广藿香中百秋李醇合成酶基因，采用原核表达方法进行功能验证，以明确该基因在百秋李醇合成中的作用；应用GC-MS法分析测试不同广藿香供试材料间百秋李醇的动态积累模式及组织分布规律，同时采用Q-PCR、Western-blot法探讨目的基因在对应组织及时间段的mRNA表达量及蛋白质含量，以探讨百秋李醇合成的分子生物学机制；从转录和翻译水平阐述昼夜节律和金属离子对百秋李醇积累和合成的影响，揭示其代谢调控机制与调控水平。本项目为整体提高广藿香中百秋李醇的含量提供理论依据和技术支撑。

广藿香是我国常用的芳香化湿类中药之一，具有芳香化浊、开胃止呕、发表解暑之功效。百秋李醇作为广藿香的活性成分之一，是历版《中国药典》规定的用于评价广藿香药材及广藿香油质量的指标成分，需求量与日俱增。由于广藿香中百秋李醇含量低，限制了广藿香、百秋李醇的规模化生产和开发利用，因而有必要对百秋李醇的生物合成与积累规律展开研究。本课题利用分子生物学和生物信息学技术克隆广藿香中百秋李醇合成酶基因，研究了百秋李醇含量的动态积累模式、组织分布特征及其与百秋李醇合成酶基因的表达调控关系，研究了昼夜节律、金属离子对百秋李醇含量的影响及分子生物学调控水平。获得PTS基因cDNA序列全长1659bp，GeneBank登录号为KP694233。起始密码子为atg，终止密码子为taa，整个序列就是一个开放阅读框，编码552个氨基酸。与GeneBank中已登记的广藿香PTS基因cDNA序列AY508730和KF98351相比，分别有53和14个碱基不同，相似性分别为97%和99%。PTS重组蛋白的理论大小约为64ku，经IPTG诱导获得的表达蛋白大小与所预测的一致。克隆出了GAPDH、β-actin、18S rRNA三个基因片段，长度分别为496bp、599bp和434bp，18S rRNA基因表达最稳定，最适于用作内参基因。PTS基因的表达在夜间出现高峰，3:00时表达量为最高。基因表达峰首先出现在凌晨，之后表达量逐渐下降。广藿香叶和茎挥发油中的百秋李醇具有相似的积累模式“先下降后上升、再下降”，而根油中百秋李醇变化呈一高一低的波浪状。广藿香叶油中百秋李醇的含量最高，其次是茎油，根油中含量最低。广藿香根、茎、叶八个生长时期中PTS基因的相对表达量与其挥发油中百秋李醇的含量均不成正比，二者变化变化趋势在根、茎、叶中均不一致，证明百秋李醇合成酶除了参与百秋李醇合成外，还参与了其他倍半萜类化合物的合成。叶面喷施一定量的Mg2+、Mn2+和Co2+能促进百秋李醇合成酶的过量表达，百秋李醇的积累亦受光照时间和光照强度的影响。本课题为整体提高广藿香中百秋李醇的含量提供理论依据和技术支撑。