ARF3非细胞自主性调控拟南芥雌性生殖细胞命运决定的机理研究

The specification of the MMC is of critical importance as it is the first committed cell of the female germline lineage. In light of this, how signaling among somatic cells, or between somatic cells and the potential MMC, occurs to ensure the specification of only one MMC is of much interest. In the previous, we found the polar distribution of ARF3 in ovule primodium mediated by tasiR-ARF controlled the MMC specification. This project intends to reveal molecular mechanism of ARF3 regulates reproductive cell fate determination in Arabidopsis. We will ①apply fusion expression system，small RNA northern blot and small RNA in situ hybridization to study the expression pattern of tasiR-ARF in ovule; ②adopt ectopic expression of ARF3 driven by different promoter to evaluate the non-cell-autonomous regulation of ARF3 on MMC specification; ③use RNA sequencing and chromatin immunoprecipitation- sequencing technology to screen ARF3 downstream genes and construct ARF3 dependent-signaling networks. Our finding will excavate more gene which are involved in MMC formation and shed light on the study of germ cell fate decision, gametes initiation and somatic cell-germ cell interactions.

植物体内存在高度精密的调控机制，准确地“指定”极少数的体细胞特化为生殖细胞。大孢子母细胞MMC的形成代表着体细胞向雌性生殖细胞的转变，标志着雌性生殖细胞的起始，其形成的分子机理还不清楚。我们在前期的研究工作表明tasiR-ARF通过靶向调控生长素响应因子ARF3在胚珠原基体细胞中的极性分布，介导了生殖细胞MMC的特化。本项目将深入揭示ARF3调控MMC特化的分子机制：①通过基因融合表达、northern 杂交及原位杂交技术检测tasiR-ARF在胚珠中的表达模式；②驱动ARF3在胚珠原基不同细胞层内的异位表达，揭示ARF3非细胞自主性调控MMC特化的机理；③通过比较转录组、ChIP-测序技术及生物学实验鉴定ARF3下游调控基因，构建ARF3调控网络。本项目将挖掘更多的参与生殖细胞命运决定的基因，为解答有性生殖过程中生殖细胞命运决定、体细胞与生殖细胞的互作等关键科学问题提供重要的参考依据。

大孢子母细胞的特化标志着植物雌性生殖细胞发育的起始。植物通过何种方式来调控并确保只有一个体细胞成功分化为大孢子母细胞的分子机理尚不明确。.我们前期的研究表明：在拟南芥胚珠发育过程中， tasiR-ARFs通过抑制其靶基因生长素应答因子3 (ARF3)在胚珠中的表达来调控MMC的特化，但是其调控机制尚不清楚。本研究首先采用启动子融合GFP及基因融合GFP的方法，详细分析了tasiR-ARF产生途径中的若干关键因子（TAS3, MIR390, AGO7及SGS3）在拟南芥胚珠中的表达模式。从这些基因的表达模式，我们推测tasiR-ARF产生于胚珠珠心组织的表皮细胞； ARF3原位杂交结果显示：tasiR-ARF沿着内外（medio-lateral）轴的方向向亚表层细胞移动，沿着远-近轴（Distal-Proximal）的方向向近轴合点端移动；我们使用胚珠不同细胞类型特异表达的启动子驱动ARF3m的表达，发现ARF3m在MMC邻近细胞中的表达致使胚珠中形成多个MMC，而在表层细胞中的表达则与野生型一致。该结果表明tasiR-ARF通过抑制ARF3在亚表层细胞中的表达来遏制这些细胞发育为MMC；通过对野生型及亚表层细胞特异表达ARF3m的转基因植株的转录组分析，我们推测ARF3可能通过植物激素途径调控MMC的特化。该研究揭示了tasiR-ARF在胚珠中的产生受到严格的控制，并且通过细胞间的移动参与了MMC的特化调控。本项目的研究目标已完成，共发表SCI收录论文3篇，其中第二标注SCI论文2篇，包括Plant Cell 1篇，Tropical Plant Biology 1篇，第七标注1篇，PNAS。参加国际和国内学术会议1次。