FcγRIIB基因修饰树突状细胞诱导大鼠肝移植免疫耐受的实验研究

The aim of the research was to construct recombinant membranes rat FcγRⅡB using molecular biologic techniques and to explore its the effects and possible mechanisms on immature dendritic cells. Immature dendritic cells were cultured ，derivated and amplificated in vitro from bone marrow stem cells of DA rats．After their morphology，immunophenotype and function were identified and confirmed，the plasmids of FcγRⅡB were transfected into imDC to detect expression of FcγRⅡB gene,apoptosis and SHIP, AKT, IKK, IKβexpression of imDC in vitro and vivo．Established the modified rat model of orthotopic liver transplantation and the rat liver transplantation model of acute rejection，then respectively intraperitoneally injected to recipient rats with distinct cells, such as mDC, imDC, empty vector-transfected imDC, FcγRⅡB-modified imDC. we also observe the pathological changes of the liver graft and immune complex deposition and apoptosis change in thymus, spleen, celiac lymph nodes, and detect hepatic function ,cytokines alteration and the levels of antibody in the serum, and the expression of FcγRⅡB and the change of signaling molecular and function on dendritic cells.Survival analysis were performed for remnant rats, except rats dead for technical factor. The recombinant membranes FcγRⅡB on immature dendritic cells could induced allogeneic rat liver transplantation immunology tolerance, This study would be establish fundamental materials and techniques for further study.

本项目以膜结合性的重组大鼠FcγRIIB为研究对象,利用分子生物学技术，构建膜结合性的重组大鼠FcγRIIB慢病毒载体；转染大鼠不成熟树突状细胞；检测其在体内、外不成熟树突状细胞上的表达，及其转染后对不成熟树突状细胞的表型、细胞凋亡反应、同种异体 T 淋巴细胞的反应性、信号转导分子SHIP、AKT 、IKK、IKβ及其mRNA表达的影响，探索FcγRIIB对不成熟树突状细胞的免疫调节作用。建立近交系大鼠原位肝移植急性排斥反应模型，通过体内使用 FcγRIIB基因修饰大鼠骨髓来源的不成熟树突状细胞，了解其能否减轻模型鼠的肝脏病理变化；改善肝功能；抑制肝、脾及腹腔淋巴结中树突状细胞和T细胞的活性并增加其凋亡；减少抗体产生；延长模型鼠的生存；揭示膜结合性FcγRIIB修饰未成熟树突状细胞诱导的同种异基因大鼠肝移植耐受作用机理，为进一步研究奠定基础。

目前，移植全部或部分肝脏已成为急性肝功能衰竭、各种良性终末期肝病以及部分原发性肝脏恶性肿瘤病人的有效治疗方法。并且肝移植术后的排斥反应明显较其他器官移植轻。随着各种新型免疫抑制药物的出现，临床上严重急性排斥反应的发生率大幅度降低，患者生存率明显提高，然而，免疫抑制剂的使用也有严重的副作用，它会诱发严重的神经、肾毒性等毒副作用以及高血脂，术后感染发生率升高等并发症；T细胞在参与肝脏移植排斥反应和诱导免疫耐受方面发挥着重要的作用。移植受体的T细胞通过TCR识别抗原提呈细胞所提呈的抗原，活化、增殖，分化为效应T细胞，迁移到移植物，发挥免疫学效应并致其损害。树突状细胞（dendritic cells,DC）是已知机体内功能最强的抗原提呈细胞,能诱导免疫应答的产生。目前认为不同发育阶段的DC有着不同的细胞表型,并与其功能密切相关,成熟DC因其表面高表达CD40、CD80等共刺激分子，因而能激活T细胞，诱导免疫应答；未成熟状态的DC(immature DC， imDC)低水平表达MHC分子,几乎不表达CD40、CD80/CD86等协同刺激分子和粘附分子,imDC具有很强的抗原摄取加工能力，但由于缺乏多种共刺激分子不能使初始T细胞活化、增殖产生免疫应答,可导致T细胞的无能，从而诱导免疫低反应。FcγRIIB作为唯一的Fcγ抑制性受体，在固有免疫和适应性免疫的负性调节方面发挥着重要生物学作用。本课题通过利用分子生物学技术构建膜结合性大鼠FcγRⅡB的慢病毒载体pLenti- FcγRⅡB，病毒学技术将慢病毒载体FcγRⅡB转染到未成熟树突状细胞，并观察得出当DOX浓度达到一定浓度时， FcγRⅡB在imDC中高表达。采用改良二袖套管法，建立以DA大鼠作为供体，Lewis大鼠作为受体的大鼠肝移植急性排斥反应模型，观察模型鼠体内信号转导分子SHIP、AKT 、IKK的蛋白及其mRNA呈现高表达，IKβ的蛋白和mRNA在对照组中低表达，在环孢素组和imDC组中高表达。同时，通过对模型鼠中注射imDC，可以延长模型鼠的生存时间，并且观察模型鼠肝脏的病理变化，对照组中的病理急性排斥反应严重，banffer评分高，环孢素和imDC组中的banffer评分明显降低。所以FcγRIIb基因修饰的供体源的未成熟树突状细胞可以有望作为诱导器官移植免疫耐受的生物制剂登上临床的舞台。