分离、鉴定肺癌细胞中与核糖体蛋白L22相互作用的蛋白分子

肺癌的主要分子特征是癌细胞无限增殖；探讨细胞增殖调控机制是肺癌研究的重点之一。核糖体蛋白对细胞增殖分化的重要调控功能是目前研究的热点。课题组发现肺癌LTEP-a-2细胞中核糖体蛋白L22（RPL22）表达明显高于正常HBE细胞；在抑制RPL22表达后，PI3K等重要的信号调控分子表达变化明显；进一步通过串联亲和纯化（TAP）等方法初筛出可能与RPL22相互作用的几个蛋白分子，质谱分析提示其中一蛋白可能为细胞增殖分化信号通路上的一个重要蛋白激酶；遂推测RPL22是癌细胞中非常关键的信号调控分子。本项目拟在前期工作基础上，进一步运用TAP结合质谱等技术，分离、鉴定LTEP-a-2细胞中与RPL22相互作用的蛋白分子，通过RNA干涉、western blot等方法研究其相关信号通路的激活和下游信号分子的表达影响；本项目预期结果对于阐明肺癌的发病机理、筛选肺癌治疗的新靶标分子具有重要意义。

课题组根据项目设计书，通过用PCR方法，结合双酶切成功构建pCeMM-NTAP(GS)-RPL22真核表达载体，再转染pCeMM-NTAP(GS)和pCeMM-NTAP(GS)-RPL22表达载体于肺癌细胞系LTEP-a-2中，通过流式细胞仪分选绿色荧光蛋白表达阳性细胞，并成功筛选出阳性细胞株；提取细胞全蛋白，按步骤过串联亲和纯化（TAP）柱分离蛋白，获得所需要的蛋白复合体，通过12%SDS-PAGE电泳分离蛋白复合体，然后通过质谱方法分析了差异蛋白带的肽质量指纹谱，并通过生物信息学方法与数据库比对分析，获得了相对应的蛋白信息；课题组通过多次重复实验，成功分离鉴定了其中6个蛋白带，其中一个为人RPL22、其余5个蛋白分子为与RPL22相互结合的蛋白分子，进一步通过western blot 方法验证洗脱蛋白中有RPL22。课题组选择了其中一个蛋白protein X进一步用GST pull-down方法验证了RPL22和差异蛋白相互作用，结果显示基于pCeMM-NTAP(GS)表达载体进行的相互作用蛋白质分离鉴定实验数据是可靠的。课题组进一步通过激光共聚焦显微镜观察了RPL22蛋白及其相互作用蛋白Protein X在293T细胞及LTEP-a-2细胞中亚细胞定位及融合情况，结果提示RPL22与Protein X蛋白在细胞内存在相互作用，进一步验证的实验数据的准确性。.课题组进一步通过siRNA方法分析了RPL22基因及其相互作用蛋白Protein X基因对肺癌细胞LTEP-a-2生物学行为的影响；通过定量PCR基因芯片方法重点分析了相关的信号转导通路。结果表明在siRNA抑制RPL22基因及Protein X基因表达后，磷脂酰肌醇(-3)激酶基因（Phosphatidylinositol 3-kinases, PI3Ks）基因表达明显变化，同时NFκBIA基因表达下调；结合相关信号转导，推测RPL22基因可能参与了PI3Ks--NF-κB信号通路调控，其可能是肺癌发生发展的重要调控基因。为进一步研究RPL22及其相互作用蛋白的在肿瘤发生特别是肺癌发生过程中的生物学调控作用，课题组在有限的经费支持下，成功构建了RPL22转基因小鼠和基因敲除小鼠嵌合体模型，目前正在进一步完善小鼠纯合子的筛选和鉴定。项目研究所得数据已总结，正在投稿SCI文章一篇，组织申请专利一项。