NifL-NifA系统调控生物固氮的分子基础

Biological nitrogen fixation（BNF）plays vital roles in life activities on the earth. Only some bacteria and archaea could utilize the nitrogenase system to uptake nitrogen from the air and convert it to ammonium which is required for the synthesis of various biological proteins and nucleic acids. Transcription of the nif gene cluster encoding nitrogenase is regulated by NifL-NifA two-component system, sensing multiple signals such as 2-oxoglutarate. NifA，an enhancer binding protein (EBP) family member, contains a central catalytic AAA+ domain and functions as an ATP-dependent helicase, which promotes open complex formation in nif gene transcription initiation via interacting with σ54 factor in RNA polymerase. NifL inhibits the transcriptional activation through interacting with NifA under conditions of nitrogen excess. On the other hand, under conditions of nitrogen limitation, NifA would bind to 2-oxoglutarate and dissociate from NifL, promoting nif gene transcription. In this proposal, we aim to determine the high-resolution structures of NifA bound to 2-oxoglutarate and NifL-NifA complex, providing insight into the molecular mechanism for transcriptional regulation of nif genes by NifL-NifA system.

作为生命活动两大基石之一，生物固氮为生物体合成蛋白质及核酸提供原料。在自然界中，仅有固氮菌及某些古细菌可通过固氮酶进行生物固氮。研究显示，编码固氮酶的nif基因簇的转录会受到2-酮戊二酸等多种信号分子调控。并且，这些信号均通过NifL-NifA系统来调控nif基因簇的转录。NifA是nif基因簇的转录激活蛋白，隶属于带有AAA+结构域的EBP家族，具有解旋酶功能，可通过与RNA聚合酶的σ54因子相互作用形成转录起始开放复合体，来激活nif基因簇的转录。NifL是nif基因簇转录的抑制因子。当胞内氮过量时，NifL可通过与NifA相互作用来抑制其转录激活功能。当胞内氮缺乏时，NifA结合2-酮戊二酸信号分子，并从NifL-NifA复合物中释放出来，启动转录。本项目拟通过解析2-酮戊二酸结合的NifA及NifL-NifA复合物的三维结构，揭示NifL-NifA调控生物固氮的分子机制。

棕色固氮菌（A. vinelandii）是自生固氮菌的模式菌株，它的NifL-NifA双组分调节系统对nif基因簇的转录进行调控。α-酮戊二酸（2-OG）是碳氮代谢共有的中间体，其水平随生物体内可用性氮和碳水平的变化而变化，直接参与调控NifA的活性。活化的NifA蛋白能够水解ATP，为σ54聚合酶行使转录起始功能提供能量。目前棕色固氮菌NifA蛋白活性转换相关结构尚未见报道，严重阻碍了NifA蛋白依赖的固氮酶基因转录激活的分子机制的研究。本课题以棕色固氮菌的NifA蛋白为研究对象，探究了2-OG和NifL调控NifA活性的分子机制，获得的成果如下：.（1）利用蛋白亲和纯化技术，获得了外源表达的棕色固氮菌全长NifA蛋白。通过凝胶过滤层析的结果发现2-OG能直接结合NifA蛋白并驱动NifA蛋白寡聚形式发生转变。通过ATP酶活实验和体外转录激活活性实验证实2-OG驱动的NifA蛋白寡聚形式的转变是NifA蛋白激活的必要过程。.（2）对NifA蛋白的不同功能结构域进行截断并提取了蛋白。通过ATP酶活实验和体外转录激活活性实验表明NifA蛋白N端的GAF结构域抑制了NifA蛋白的活性，2-OG解除了GAF结构域对GAF结构域对NifA蛋白的活性的抑制。.（3）利用冷冻电子显微镜技术，采用单颗粒重构的方法分别解析了2-OG结合前后全长NifA蛋白原子分辨率（2.8-3.6Å）的三维空间结构。结构分析证实在2-OG结合前全长NifA蛋白主要形成22聚体（90.1%），2-OG结合后则形成7聚体。对22聚体构象维持的可能位点或者界面进行突变并提取蛋白，利用ATP酶活实验和体外转录激活活性实验证实Coiled-coil结构对于22聚体的构象维持起关键作用..（4）利用蛋白质晶体学的方法阐述了2-OG分子在调控NifA功能的生理角色。成功解析了NifA（12-185）蛋白结合和未结合2-OG的晶体结构（1.3-1.6Å），发现2-OG结合在GAF结构配体结合口袋中导致Coiled-coil结构的弯曲，激活NifA活性。.(5) 解析了NifL的PAS1的两个晶体结构，初步揭示氧化还原通过NifL调控NifA活性的分子机制。.上述结果有助于我们更加深入地理解2-OG和NifL调控NifA依赖的固氮酶转录起始的动态过程，为结构指导的基因编辑以开发绿色高效的生物肥料研究奠定了理论基础。