ClpCP蛋白水解酶复合体组装的结构基础

MecA介导的ClpCP蛋白水解酶复合体参与了枯草芽孢杆菌中许多生理过程。为维护细胞正常的生理功能，具有ATP水解酶活性的调节亚基ClpC以六聚体形式同七聚体的催化亚基ClpP形成复合物，并以ATP依赖的方式降解损伤蛋白质以及特异性蛋白质底物。但是6：7这种不对称组装的分子机制尚无研究报道给出明确的解释。本项目将主要运用X-射线晶体衍射技术并辅以电镜技术来测定MecA所介导的ClpCP蛋白水解酶复合物的三维结构。并以结构为基础，结合生物化学、生物物理学和生物信息学等相关技术手段来阐释ClpCP组装的分子机制。本项研究工作不仅能够揭示原核细胞内ATP依赖的蛋白水解酶复合体的组装机制，还能为研究真核生物内更为复杂的泛素－蛋白酶体系统提供方法论和实验基础，特别是6：7不对称组装方式的揭密将是结构生物学研究史上的重要篇章。

ATP依赖的可调控蛋白降解过程在生物体内广泛存在。ClpCP复合物是枯草芽孢杆菌菌内参与这一过程的主要分子机器，其中执行去折叠酶功能的ClpC蛋白隶属于AAA+蛋白（与各种细胞活动相关的ATP水解酶）超家族中的Clp/Hsp100家族，该家族成员大多以六聚体形式发挥功能。ClpC蛋白有两个ATP结合结构域（D1和D2结构域），其底物识别和激活需要一类接头蛋白MecA的介导才能完成。激活后的MecA-ClpC六聚体分子机器利用ATP结合和水解所释放的能量将特异性的底物蛋白进行去折叠并将实现去折叠的多肽链转移到与之相互作用的ClpP蛋白酶内进行降解。在先前的研究中，我们报道了MecA C端结构域和 D2结构域切除的ClpC形成的六聚体复合物；以及MecA C端结构域和全长ClpC形成的六聚体复合物，揭示了MecA-ClpC六聚体复合物的组装方式，并阐释了MecA促进ClpC六聚化并进一步激活的分子机制。在本项目中，为了阐明MecA-ClpC在底物识别、去折叠及转运过程的分子机制，我们利用冷冻电子显微镜技术所获得的MecA-ClpC复合物的四种不同结构。这些复合物在两个AAA+环的核酸结合状态上存在明显差异，可能反映了该六聚体复合物在去折叠底物的周期中的不同状态。结构分析表明，核酸的结合和水解通过多种方式调节了该六聚体复合物的构象变化，包括N端环的开口、中轴和pore loops的径向位置、C端环的收缩以及上下两个环状结构之间的相对旋转等。更重要的是，我们的结构和生化数据表明，在上下两个AAA+环之间存在一个有效的别构调节作用，并且两个AAA+ 环之间的互动对于有效的去折叠并转移底物十分必要。这些研究发现既加深了我们对于MecA-ClpC复合物去折叠底物过程中构象变化的理解，还为我们进一步全面地理解第二类带有AAA+结构域的六聚体蛋白在ATP水解周期中的构象变化奠定了理论和方法学上的基础。