骨髓间充质干细胞介导TGF-β通路靶向干预治疗慢性胰腺炎的实验研究

胰腺间质纤维化是慢性胰腺炎的重要病理特征，也是该病的重要临床病理生理基础。研究表明胰腺星状细胞（PSCs）等多种细胞参与纤维化过程，而TGF-β通路活化是该进程的关键环节之一，阻断TGF-β通路有望减轻胰腺间质纤维化，从而缓解慢性胰腺炎病情。前期实验结果显示，骨髓间充质干细胞（MSCs）可以定向迁移到慢性胰腺炎组织损伤部位。因而，本研究拟通过三硝基苯磺酸(TNBS)胰管内逆行注射制作慢性胰腺炎大鼠动物模型，观察TGF-β信号通路与慢性胰腺炎病情变化的联系，初步探讨该通路促进慢性胰腺炎发展演变的作用机制。而后，构建出缺陷表达TGF-βⅡ型受体(TβRⅡ)的转基因MSCs，使之靶向迁移到慢性炎症病灶，诱骗结合游离TGF-β，区域性降低TGF-β水平，进而下调该通路，降低PSCs活化，达到负调控TGF-β信号通路的目的，以期为慢性胰腺炎治疗寻找新的分子靶向目标。

1.完成了慢性胰腺炎模型的制作与评估。初步评价与比较雨蛙素注射、胰胆管结扎及精氨酸注射三种慢性胰腺炎造模方法。结果显示造模后各时间点，各组谷丙转氨酶、血糖、TNF-α、IL-1β水平无明显差异，注射后3d，Cerulein组胰腺病理评分明显低于Ligation组和Arginine组。三组均可见胰腺组织胶原染色。Cerulein组3d时TGF-β表达低于Ligation组。2.完成了骨髓间充质干细胞传代培养与功能鉴定3.检测实验性慢性胰腺炎(CP)造模后不同时间段内骨髓间充质干细胞(MSCs)的.数量和增殖能力。结果显示CP造模后3d、7d、14d的原代培养骨髓细胞的克隆形成率均显著高于对照组；获取的MSCs细胞比例显著高于对照组的。CP不同时间段MSCs数量和增殖能力发生改变，经历了先增加后减少的过程。4.观察骨髓干预对L-精氨酸诱导慢性胰腺炎模型的影响，将大鼠分为6组，三组以L-精氨酸制备CP模型，其中两组分别以白消安和G-CSF预处理诱导骨髓抑制和骨髓动员。其余三组分别腹腔注射白消安、G-CSF和0.9% NaCl溶液。结果显示骨髓抑制-CP大鼠7 d生存率明显低于骨髓动员-CP大鼠和CP大鼠。三组CP大鼠病理学评分显著高于相应非CP大鼠，而血清淀粉酶水平无明显差异。骨髓抑制组、骨髓抑制-CP组外周血和骨髓有核细胞数量显著减少，骨髓动员组和骨髓动员-CP组外周血和骨髓有核细胞数量明显增多。骨髓抑制组CD29+CD44+CD45-细胞比例显著低于骨髓动员组和正常对照组。骨髓抑制-CP组MSCs细胞比例显著低于骨髓动员-CP组和CP组。MSCs功能状态与CP病情相关，MSCs在CP时发挥保护作用，促进损伤修复。.5.TGF-b缺陷表达载体构建，缺陷表达MSC功能鉴定,结果显示TGF-β1信号通路中, 可溶性TβRII能抑制TGF-β1信号传导。.6.观察MSCs移植对CP的治疗作用，获取雄性SD大鼠MSCs，造模后24h输注P3代以上MSCs， PCR法检测Y染色体sry片段。MSCs荧光标记在体鉴定，流式检测CFSE阳性细胞。结果显示输注治疗组胰腺、肺脏、肝脏、心脏、肾脏组织可以检测sry基因片段。输注治疗组胰腺、肺脏TNF-α，IL-1βmRNA表达显著低于CP未治疗组（P<0.05）。输注治疗组72h生存率高于CP未治疗组。