稗草抗二氯喹啉酸、五氟磺草胺和双草醚的多抗性分子机理研究

Barnyardgrass (Echinochloa crusgalli) is one of the worst weeds in rice fields of China. The development of multiple barnyardgrass resistance to herbicides is a serious threat to rice production. Unfortunately, little is known about the genetic mechanism of multiple resistance of E. crusgalli. In our previous work, we successfully screened multiple-resistant strain that shows high resistance to three kinds of herbicides (quinclorac, penoxsulam and bispyribac sodium salt), quinclorac-resistant strain, penoxsulam-resistant strain, and bispyribac sodium salt-reistant strain barnyardgrass. With these valuable material, we plan to investigate the molecular mechanism of resistance. The cDNAs of cyanoalanine synthase, acetolactate synthase and glutathione S transferases gene will be first obtained by PCR cloning followed by sequencing. The putative mutations in these genes will be found by sequence alignment. The mRNA abundance of the target gene will be determined by qRT-PCR after inducing by quinclorac, penoxsulam and bispyribac sodium salt. The mRNA changes between different treatments including herbicides inductions, CAS or GST inhibitor treatments will be compared to analyze the impact of these chemical herbicides on the transcription. Finally, we will express these genes by using yeast expression system. The protein products will be purified and their biological characteristics will be analyzed to uncover their gene functions. This project will provide new insights into the molecular mechanism of multiple resistance of barnyardgrass and will be great helpful to developing new strategy for field weed management.

稗草（Echinochloa crusgalli.）是我国水稻产区最主要的恶性杂草之一，稗草多抗性种群的发展将严重威胁水稻的安全生产，但是其抗性机制尚未清楚。申请者在前期研究结果的基础上，拟以稗草多抗性（兼抗二氯喹啉酸、五氟磺草胺和双草醚）、单抗（二氯喹啉酸、五氟磺草胺或双草醚）和敏感生物型为研究材料，采用分子生物学等多学科研究方法，首先克隆稗草的氰丙氨酸合成酶(CAS)、乙酰乳酸合成酶（ALS）与谷胱甘肽-S-转移酶(GST)基因，并在Genbank 上进行比对分析，确定靶标基因的突变位点；经二氯喹啉酸、五氟磺草胺和双草醚诱导后，测定供试材料靶标基因转录水平，分析它们之间靶标基因-mRNA 的相对表达差异及CAS 与GST 抑制剂对靶标基因转录的影响，最后将克隆的基因在酵母表达系统中进行表达，分离纯化其表达产物，研究克隆基因的功能。以上结果可发现稗草产生多抗性的新机制，为制定绿色防控农田杂草的策略提供依据。

稗草（Echinochloa spp.）是我国稻田中最主要的恶性杂草之一，其对除草剂产生的多抗性及其抗性种群的扩展必将威胁水稻的安全生产。以抗二氯喹啉酸、五氟磺草胺和双草醚的多抗性稗草作为研究对象，克隆稗草中的除草剂靶标和非靶标基因，比较它们在多抗性稗草是否发生点突变；研究经二氯喹啉酸、五氟磺草胺和双草醚诱导后，测定其在多抗性和敏感性稗草中的基因表达水平；研究了GST介导的除草剂代谢解毒机理；研究了稗草对二氯喹啉酸的抗药性机理；分析了它们在大肠杆菌中的原核表达特性及转基因功能研究。研究结果发现，抗药性稗草中ALS靶标基因发生氨基酸突变，即在对应的拟南芥ALS的574位色氨酸Trp突变成亮氨酸Leu。qPCR分析表明抗性稗草ALS基因表达量是敏感性稗草的4.47倍。因此，抗药性稗草中ALS靶标基因点突变和ALS表达量的增加导致了稗草对五氟磺草胺产生高抗性，抗性指数达95以上；通过对比施药前后不同抗性稗草的EcGSTs基因的相对表达量，发现施药后表达量高于施药前，EcGSTF1表达量高于EcGSTZ1，多抗性稗草表达量高于敏感性稗草，说明EcGSTs基因的表达与解毒代谢关系密切；氨基酸序列比较结果发现乙烯生物合成途径相关基因（ACS、ACO和β-CAS）在多抗性稗草中均存在突变位点。qPCR分析结果发现，经二氯喹啉酸处理后，多抗性稗草中的ACS和ACO基因表达量较敏感性稗草中低，而β-CAS基因表达量在处理后的多抗性稗草中显著增加。通过原核表达蛋白，用气相色谱仪分析单位时间内乙烯的生成量，乙烯释放速率结果发现：敏感EcACO2基因表达纯化产物单位时间内5μg EcACO2蛋白乙烯释放量是抗性EcACO2基因的2.15倍。因此推断乙烯生物合成途径中关键性基因可能是稗草对二氯喹啉酸产生抗性的机理。将多抗性稗草的GST、ACS、ACO和β-CAS基因进行转基因拟南芥，成功获得了转基因T2代植株。项目实施结果深入阐明了稗草对二氯喹啉酸和ALS抑制剂类除草剂产生多抗性的分子机制，为未来作物生产中如何有效防控抗性杂草种群提供可靠的理论依据。