稗草对二氯喹啉酸的抗药性机理研究

The barnyardgrass(Echinochloa crusgalli(L.)Beauv.)is the most troublesome weed throughout rice production areas of our country. Quinmerac is the herbicide frequently used in rice fields, Which effectively control barnyardgrass. However, The occurrence of barnyardgrass resistance to quinmerac constitutes a major threat in rice yield safety. At present, the relevant resistance mechanism has not been clarified. In our former studies, The results showed that causing lower stimulation of target enzyme (1-aminocyclopropane-1-carboxylate synthase, ACS) activity in R than in S plants after quinclorac treatment. It was suggested that the main reason for the resistance of quinmerac lies in the lower sensitivity to the herbicide of the site of action and belonged to a target site-based mechanism of resistance. Laboratory studies are conducted using resistant and susceptible barnyardgrass biotypes.The study will show that two relevant mechanisms contribute towards barnyardgrass resistance to the herbicide quinclorac. The first goal of this study was to clone and sequence the ACS genes of the resistant and susceptible barnyardgrass biotypes. Comparison of the ACS gene sequences were conducted to elucidate whether gene is substituted. Then quantitative analysis was conducted by SYBR Green I real-time fluorescent quantitative PCR to detect the expression levels of ACS gene between resistant and susceptible barnyardgrass biotypes. The conclusions of research project should be importantly to elucidate the mechanism of resistance of the herbicide quinmerac. In addition, which can provide the theoretical basis for the integrated manangement and effectively controlled resistance weed.

稗草（Echinochloa crusgalli(L.)Beauv.）是我国水稻产区最主要的恶性杂草之一，而二氯喹啉酸是我国水稻田长期使用的经济、有效、安全的除稗剂。抗二氯喹啉酸的稗草种群已严重影响水稻的安全生产，但其抗性机制至今尚未阐明。申请者在前期研究中发现1-氨基环丙烷-1-羧酸合成酶(1-aminocyclopropane-1-carboxylate synthase, ACS)可能是抗性靶标，本研究将以靶标酶ACS为研究对象，利用分子生物学技术首先对ACS基因进行克隆，以期获得稗草不同生物型ACS基因的全长cDNA序列，确定ACS基因的突变位点；其次采用实时荧光定量PCR明确经二氯喹啉酸诱导处理后不同生物型稗草ACS-mRNA转录水平差异。从而阐明稗草对二氯喹啉酸的抗性机理。项目的研究结果不仅可揭示稗草对二氯喹啉酸的抗药性机理，也可为制定合理的控制抗药性杂草的策略提供科学依据。

本项目以稗草的抗、感生物型为试验材料，采用分子生物学方法，克隆获得稗草ACS基因的4段保守序列，获得长度为987bp的目的片段，推导出329个氨基酸。比对不同生物型稗草（R、S）的ACS基因片段的保守序列。发现两者的ACS基因序列推导的氨基酸相同，未见突变发生。采用RACE技术克隆ACS基因3’末端和5’末端，获得了稗草ACS基因序列长度为1,679bp和推导出的461个氨基酸。该序列与小米(Setaria italica）ACS基因一致性为93%，与甘蔗（Saccharum）的ACS基因一致性为90%，与高粱（Sorghum bicolor）ACS基因一致性为90%，与玉米（Zea mays）ACS基因一致性为89%，与大麦（Hordeum vulgare）ACS基因一致性为88%,与水稻（Zea mays）ACS基因一致性为87%。.SYBR Green I 实时荧光定量 PCR结果表明：R生物型稗草经二氯喹啉酸处理后，ACS-mRNA的表达水平先上升，在第7d达到最高，后来维持在该水平不再发生变化。而S生物型稗草经二氯喹啉酸处理后，ACS-mRNA的表达水平在处理后第1天上升到最高，处理3d后下降到最低，5d、7d、11d 后S生物型ACS-mRNA的表达水平逐渐维持在同一水平不再发生变化。这说明稗草中ACS-mRNA的过量表达可能才是其产生抗药性的原因。.从生理生化方面测定了不同生物型稗草1-氨基环丙烷-1-羧酸合成酶（ACS）及β-氰丙氨酸解毒酶（β-CAS）的活性，结果表明，稗草抗药性的产生与其ACS及β-CAS活性变化紧密相关。抗性生物型稗草用二氯喹啉酸处理后，ACS酶活性不仅没有被诱导，反而降低，虽然处理后2 d稍有回升，但始终低于同期对照。抗性生物型稗草经二氯喹啉酸处理后，解毒酶β-CAS被诱导，酶活性显著升高，在处理后9 d内均维持较高的活性，因而导致抗性稗草因二氯喹啉酸作用而产生的氰化物被β-CAS迅速降解而解毒，稗草不能死亡。从结果看，ACS和β-CAS与稗草对二氯喹啉酸的抗性密切相关。.研发了一种简单、快速检测稗草抗药性的方法。该方法已申请国家专利，并获得了授权。测定发现抗二氯喹啉酸的稗草对六种除草剂（五氟磺草胺、双草醚、嘧啶肟草醚、氟吡磺隆、噁唑酰草胺、氰氟草酯）均无多抗药性产生。应用3种不同除草剂配方组合在不同年份轮换使用可有效防