c-FLIP调控细胞坏死性凋亡在糖尿病肾病进展中的作用及机制研究

Diabetic nephropathy(DN) is early accompanied by podocyte injury that can result in proteinuria and glomerulosclerosis.A new mode of programmed cell death has recently been described, termed necroptosis.It may cause the injury, death and detach of podocyte and the tissue damage in DN.c-FLIP expression was found in kidney cortex and tubular epithelial cells,c-FLIP play an essential role in the regulation of necroptosis.The mechanism of necroptosis in DN is still unclear. Further research is required to determine the specific role of necroptosis and the regulation by c-FLIP.The rat podocytes were treated by high glucose and Sprague- -Dalwley(SD) rats by streptozotocin.The expression of RIP1、RIP3、c-FLIP、podocin、nephrin、IL-6 and NF-kB in podocytes and renal tissue were detected by real-time PCR、immunohisochemistry、laser confocal microscopy and western blot analysis; Electron microscopy was used to explore the cellular morphology of podocytes.We tested the same indicators when the podocytes treated with Nec-1 and diabetic Rats with anti IL-2R antibody.The aim of this study was to confirm the effects of the necroptosis pathway activation on renal cell injury to DN and whether blocking necroptosis pathway could attenuate this injury through increasing expression of c-FLIP in vitro and in vivo.

糖尿病肾病(Diabetic nephropathy,DN)早期就伴随有足细胞损伤，进而可导致蛋白尿及肾小球硬化。坏死性凋亡是近年发现的一种新型细胞程序化死亡方式，可能导致DN的足细胞和肾组织损伤。研究发现c-FLIP在肾皮质和肾小管上皮细胞均有表达，并且在调控坏死性凋亡途径中起着至关重要的作用。坏死性凋亡在DN进展中的作用以及受c-FLIP调控的机制需要深入研究。高糖刺激大鼠足细胞以及建立1型DN模型，采用电镜、real-time PCR、免疫组化、激光共聚焦及western-blot检测足细胞形态和RIP1、RIP3、c-FLIP、podocin、nephrin、IL-6及NF-kB的核酸和蛋白表达。敲除或调高c-FLIP的表达后，同样检测以上指标。了解坏死性凋亡是否介导了DN大鼠的足细胞和肾组织损伤；增加c-FLIP的表达是否通过减轻细胞坏死性凋亡起到保护DN肾脏的作用。

坏死性凋亡是近年发现的一种新型细胞程序化死亡方式，可能导致糖尿病肾病的肾实质细胞和肾组织损伤。研究发现c-FLIP在肾皮质和肾小管上皮细胞均有表达，并且在调控坏死性凋亡途径中起着至关重要的作用。坏死性凋亡在DN进展中的作用以及受c-FLIP调控的机制需要深入研究。我们做了一下实验：1、对大鼠肾小球内皮细胞(RGEs)进行体外培养实验，将RGEs根据不同干预条件随机分为以下四组：正常组、甘露醇组、高糖组、高糖+Nec-1组。采用免疫细胞化学、免疫荧光检测各组RIP1、RIP3和IL-6的表达位置及定量，采用蛋白印迹法（WB）检测各组RIP1、RIP3和IL-6的蛋白表达情况。结果显示RGEs发生坏死性凋亡明显增多，进而遭受了较多的炎症反应和损伤，而使用了坏死性凋亡特异性阻断剂Nec-1干预后，以上指标的表达均下调，Nec-1可能通过阻断坏死性凋亡途径，减轻RGEs的炎症反应和损伤。2、与上一个实验类似，RGECs在高糖刺激下，并使用重组人肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白（rhTNFR:Fc）干预，RGECs发生坏死性凋亡明显增多，进而发生了较明显的炎症反应和损伤，而使用了重组人肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白（rhTNFR:Fc）干预后，TNF-α、RIP1、RIP3和IL-6的核酸和蛋白表达均下调，说明rhTNFR:Fc可能通过抑制TNF-α在RGECs的表达，进而部分阻断坏死性凋亡途径，减轻了RGECs的炎症反应和损伤。3、糖尿病大鼠肾组织中细胞型Fas相关死亡域蛋白样白介素-1B转换酶抑制蛋白（c-FLIP）的表达量减少，并与糖尿病肾组织损伤有关；糖尿病大鼠肾组织中细胞坏死性凋亡标志物RIP1和RIP3表达增加，坏死性凋亡途径的激活可导致肾脏组织损伤；c-FLIP的表达量与RIP1和RIP3呈负相关，糖尿病肾病时，c-FLIP在肾脏中的低表达可能引起坏死性凋亡途径的激活，进而导致肾脏组织损伤。4、坏死性凋亡途径激活可能参与了糖尿病肾病大鼠肾组织细胞的炎症反应和损伤。Nec-1可能通过抑制坏死性凋亡途径而减轻糖尿病肾病肾组织的炎症反应和损伤。综上，抑制坏死性凋亡通路和增加c-FLIP的表达可以通过减轻组织细胞的坏死性凋亡而起到保护DN肾脏的作用。