共附生交替假单胞菌中次生代谢基因模块结构研究

海洋生物中数目众多的次生代谢产物很可能是由其共附生微生物合成的（第一生产者假说）。综合分析已发现的许多海洋动物次生代谢产物的结构特征，结果发现绝大部分化合物都或多或少的具有微生物次生代谢的痕迹。在此基础上，90年代由Paul Scheuer提出了"第一生产者假说"。共附生微生物来源的天然产物主要来自于其自身的次生代谢，其中许多天然产物可以通过模件分析来阐明其生物合成的途径（天然产物的基因学证据）。次生代谢产物模件分析不仅是天然产物基因工程化生产的必要基础，也是用于组合生物合成的功能元件，同时也为开发具有我国自主知识产权的来自于海洋微生物的聚酮或非核糖体肽类天然产物提供重要的基因学方面的证据。这于国于民都具有十分的必要性，同时也有美好的产业化前景。

采用生物活性和功能基因相结合的筛选策略建立了一套快速筛选含有PKS或NRPS生物合成途径的技术方法。运用该方法从325株海洋微生物中筛选到53株具有生物活性的菌株，其中大多数属于Pseudoaltermonas属。对上述筛选出的活性菌株进行功能基因的二次复筛，最终获得10株含有KS结构域或A结构域的海洋微生物菌株。随后以同属Pseudoaltermonas的2株菌NJ631和NJ632为研究对象，分别采用Fosimid文库构建筛选和全基因组精细图测序分析的策略对其中次生代谢生物合成基因簇进行挖掘。在NJ631中发现了一个PKS/NRPS杂合的由7个连续模件组成的生物合成基因簇“NJ631 NRPS-PKS”。在NJ632中发现了一个由6个连续模件组成的NRPS生物合成基因簇“NJ632 NRPS”。. 运用模块分析软件AntiSMASH从NJ632中共发现40个A结构域，这是首次在海洋交替假单胞菌中发现如此大量的A结构域模件。随后分别应用SBSPKS和NRPSpredictor2 两个软件对其底物特异性进行分析预测，结果显示除大部分的底物特异性预测一致外，有部分的A结构域在两种软件的预测下呈现完全不同的底物特异性。为此，我们选择A31结构域进行体外异源表达并分析其对20种氨基酸的选择性，结果显示除谷氨酸外，对其余19种氨基酸均具有一定的选择性，这与先前通过软件预测的结果截然不同，提示A结构域底物特异性预测软件存在一定的偏差性和局限性。除NRPS中的A结构域外，针对TE结构域，成功开发了由其介导的体外线性多肽环化催化体系。运用该套体系将抗肿瘤化合物Cliengtide线性闭环反应缩短为6 h，反应速度是常规催化化学法的8倍。 . 对前期筛选到的10株海洋微生物的次生代谢产物进行了系统性分离。最终从ESB-2中分离到两个化合物，结构鉴定分别为聚酮类化合物MacrolactinA和B。随后，我们对Macrolactin A的发酵条件进行优化，结果显示最大产量发酵条件为蛋白胨14.8 mg/mL，酵母膏1 mg/mL，FePO4 0.01 mg/mL，温度26.3 °C，初始pH值为6.0，装液量72.4%，转速150 r/min，接种量5%，共培养2天。.本项目共发表学术论文6篇，其中SCI论文3篇，国内一级学报3篇，培养硕士研究生4名，其中2名毕业。