循环纤维细胞的类干细胞特性及其在矽肺中的作用、机制与生物标志价值

It was attached great importance to fibroblasts/myofibroblasts as important end effector cells in the process of silicosis pulmonary fibrosis. Recent studies had shown that circulating fibrocytes derived from bone marrow could be a major source of fibroblasts / myofibroblasts, which followed the lung fibroblast cells and alveolar epithelial mesenchymal transdifferentiation. Circulating fibrocytes had chemotactic in response to inflammation, and differentiation ability like stem cell. It wsa closely related tomany diseases, but its relationship with silicosis has not been reported. This research will carry out from cell, animal, the crowd with the methods and technics of cell biology, molecular biology and epigenetics. To establish a cells coculture model of silicosis in vitro, use confocal, electron microscopy, flow cytometry to verify the characteristics of circulating fibrocytes like stem cell. Use chip and co-immunoprecipitation experiments to explore epigenetic changes and compare the identical and difference with lung fibroblast cells, alveolar epithelial cells transdifferentiation. Establish silica dust aerosol dynamic inhalation animal model. Use fluorescence labeling, immunohistochemistry and flow cytometry to observe the morphological changes and the number of circulating fibrocytes in peripheral blood and lung tissue. And detect the the source and distribution of myofibroblasts in fiber tissue. Carry out case-control study, and detect the level of circulating fibrocytes and related factors in blood, sputum, and bronchoalveolar lavage fluid of workers exposed to dust and silicosis patients. And explore their value. It will provide new ideas and theory evidence for further reveale silicosis silicosis, find indicators of biological monitoring and early diagnosis, and seek for potential targets for intervention.

成纤维细胞/肌成纤维细胞作为矽肺纤维化过程中重要的终端效应细胞受到高度重视。近年研究提示循环纤维细胞具有炎症趋化、类干细胞分化等特性，可能是成纤维细胞/肌成纤维细胞的又一主要来源，但其与矽肺发病的关系尚未见报道。拟建立细胞共培养矽肺体外模型，应用激光共聚焦、电镜、流式细胞术等验证循环纤维细胞的类干细胞特性和多向转化能力，采用高通量芯片、免疫共沉淀等技术探索其表观遗传变化规律，比较其与肺成纤维细胞、肺泡上皮细胞转分化的同异；建立矽尘气溶胶动式染毒动物模型，采用荧光标记、免疫组化、流式细胞术等观察循环纤维细胞在外周血、肺组织中数量、形态变化规律及纤维化组织中肌成纤维细胞的来源分布；通过病例对照调查，检测接尘工人、矽肺病人血液、诱导痰、支气管肺泡灌洗液中循环纤维细胞及相关因子水平，探讨其生物标志价值。研究将为进一步揭示矽肺的发病机制，寻找有效的生物监测、早期诊断指标及潜在的干预靶点提供新的思路。

矽肺是最严重的职业病类型之一，发病机制尚不清楚，但其发生过程中，成纤维细胞/肌成纤维细胞活化、大量分泌胶原蛋白并最终导致肺组织广泛纤维化被认为是关键的细胞事件。既往研究中主要关注肺成纤维细胞转分化为肌成纤维细胞，以及肺泡上皮细胞的EMT过程，近年来研究发现循环纤维细胞(circulating fibrocyte, CF )具有炎症趋化、类干细胞分化的特性，可能是成纤维细胞/肌成纤维细胞的又一主要来源，但在矽肺发生过程中尚未被关注。肌成纤维细胞的来源至少有上述三种，但其间存在何种相关关系也缺乏研究。因此，该课题建立大鼠矽肺模型，辅以体外实验，采用流式细胞术、免疫荧光、电子显微镜观察等实验技术，系统研究循环纤维细胞在矽肺炎症与纤维化形成期动态变化及可能作用与机制，以及不同来源肌成纤维细胞之间的关联，进一步深化对矽肺发病机制的认识，寻找矽肺潜在的生物学标志及可能的关键靶点。结果显示，在体外细胞培养过程中，经SiO2刺激，肺成纤维细胞、肺泡上皮细胞和循环纤维细胞均可稳定转化为肌成纤维细胞，其调控机制可能均涉及表观遗传学变化。在大鼠矽肺模型中，染尘初期CF主要位于血管和炎细胞聚集处，纤维化期可见CF存在于纤维结节内，其间CXCR4、CXCL12、p-PI3K、p-Ser473-Akt、p-mTOR蛋白含量均出现明显变化；大鼠外周血、肺组织单细胞悬液中CF的比例在不同染尘时间均高于对照组；染尘不同时段，CF来源的肌成纤维细胞比例约15%～35%，而II型肺泡上皮细胞来源的肌成纤维细胞约9%～21%，计算肺成纤维细胞来源肌成纤维细胞的比例约为40%～65%。循环纤维细胞和肺泡II型上皮细胞来源肌成纤维细胞在染尘初期呈升高趋势，染尘后期呈下降趋势，肺成纤维细胞来源的肌成纤维细胞与上两者趋势相反。因此，该课题认为，矽肺发生过程中，关键效应细胞——肌成纤维细胞可来源于肺成纤维细胞、肺泡上皮细胞和循环纤维细胞，在矽肺进展不同阶段三种来源之间存在一定的比例关系变化；其中循环纤维细胞可能在矽肺发生早期就活化PI3K/AKT/mTOR信号转导通路，促进CXCR4、CXCL12蛋白的表达，进而通过CXCR4/CXCL12趋化轴迁移作用由血入肺，在矽肺发生早期作为肌成纤维细胞来源的重要补充。