二氧化硅粉尘诱导肺成纤维细胞转分化的表观遗传学调控机制

肺成纤维细胞转分化是矽肺发生发展的重要细胞基础，其基因表达差异明显，机制尚不清楚，表观遗传学调控可能具有重要作用。系统、深入研究SiO2粉尘诱导肺成纤维细胞转分化过程中的表观遗传学调控效应及规律，对于阐明矽肺发病机制具有重要意义。本研究拟构建矽肺大鼠模型及大鼠巨噬细胞与成纤维细胞共培养体外模型，采用基因芯片和高效液相色谱法观察SiO2粉尘诱导肺成纤维细胞转分化前后基因组DNA甲基化水平，并检测差异表达基因及DNA甲基化调控基因的mRNA水平；采用结合高通量测序的染色质免疫共沉淀技术绘制转分化前后的组蛋白修饰图谱，并检测组蛋白修饰酶基因的mRNA水平；选取矽肺患者支气管肺泡灌洗回收液中的成纤维细胞进行培养检测，观察其表观遗传学调控效应。为扩展对矽肺发生发展规律的认识，探索生物标志和可能的干预靶点提供实验基础，并为其它肺纤维化疾病的研究提供新的思路。

目的：探讨SiO2粉尘诱导肺成纤维细胞转分化过程中的表观遗传学调控机制。方法：原代培养大鼠肺泡巨噬细胞与成纤维细胞并构建共培养体外模型，采用RT-PCR、ELISA、流式细胞术检测α-SMA、COLⅠ和COL Ⅲ，HLPC和MeDIP-Seq检测基因组DNA甲基化水平， qRT-PCR和ELISA方法检测DNA甲基化酶的mRNA和蛋白水平，ChIP-chip检测组蛋白修饰的甲基化改变情况。建立大鼠矽肺模型，于3、6、9和12周处死大鼠， HE染色对肺组织进行观察， qRT-PCR检测DNA甲基化调控基因的mRNA水平。结果：SiO2组α-SMA、COLⅠ和COL Ⅲ mRNA和蛋白表达随SiO2剂量的增大而增多。与0 μg/ml组相比，25、50、100 µg/ml SiO2组整体甲基化水平降低，与100 µg/ml SiO2组相比，DAC处理后甲基化水平降低。MeDIP-Seq结果显示，24 h组与对照组相比，98944个基因出现甲基化显著改变(50929个上调，48015个下调)；48 h组与对照组相比，100327个基因出现甲基化显著改变(41407个上调，58920个下调)；48 h组与24 h组相比，106824个基因出现甲基化显著改变(42339个上调，64485个下调)。与0 μg/ml组相比，SiO2组DNMT1、DNMT3a和MBD2的mRNA和蛋白的表达降低，DAC组表达最低 。ChIP-chip检测出 1815 个基因存在 H3K4 显著性差异( 518 个增高，1297 个降低),1850 个基因存在 H3K27显著性差异( 198 个增高，1652 个降低)。Ash1、EzH2、MLL5、G9a、KDM5A和KDM6B mRNA表达随SiO2浓度的增大而降低。与对照组相比，3 周时Dnmt3a、Mbp2、ASH1和G9a mRNA表达降低， 6 周时Dnmt1、Dnmt3a、Mbp2、ASH1、G9a和KDM5A mRNA表达增高，9周时 Dnmt3a、ASH1、G9a和KDM5A mRNA表达降低， 12 周时Mbp2、EzH2、G9a和 KDM5A mRNA表达降低。结论：SiO2粉尘诱导肺成纤维细胞转分化过程中有明显表观遗传学变化，与染毒的剂量和时间均存在相关关系，受相关甲基化酶的调控，变化明显基因的变化规律和作用机制有待进一步研究。