硫氧还蛋白及其还原酶的同型半胱氨酸化：定位、机理及意义的研究

本实验室发现，同型半胱氨酸及其巯基内酯抑制硫氧还蛋白（Trx）/硫氧还蛋白还原酶（TrxR）活性。因为Trx/TrxR是抗氧化和抗细胞凋亡的关键蛋白，其活性异常会导致细胞损伤，于是推测Trx/TrxR有可能介导了高同型半胱氨酸的细胞毒性作用。近年来，已证明蛋白质同型半胱氨酸化是某些蛋白质翻译后修饰形式，但Trx/TrxR同型半胱氨酸化尚未研究过。我们前期实验结果提示，Trx/TrxR有潜在的同型半胱氨酸化位点，很可能是同型半胱氨酸与氧化还原系统、细胞凋亡途径联系的交汇点。因此，该项目拟深入探讨以下内容：（1）同型半胱氨酸及其巯基内酯修饰Trx/TrxR的位点及酶学机制；（2）高同型半胱氨酸对血管内皮细胞Trx/ASK1凋亡信号途径的影响；（3）血浆Trx/TrxR活性在健康人与高同型半胱氨酸血症/冠心病人间的差异。以期证明Trx/TrxR同型半胱氨酸化在高同型半胱氨酸致病机制中起重要作用。

本项目完成了预期目标，在分子、细胞及整体水平上阐明硫氧还蛋白（Trx）/硫氧还蛋白还原酶（TrxR）与同型半胱氨酸的关系。（1）TrxR/Trx在DNA合成、细胞凋亡及血液凝固中起重要作用。我们的研究结果揭示，人胞浆硫氧还蛋白（hTrx1）是同型胱氨酸和同型半胱氨酸巯基内酯的靶点。同型胱氨酸通过修饰hTrx1-Cys73促进分子间形成二硫键，而同型半胱氨酸巯基内酯通过修饰hTrx1-Lys32，-lys81 和-Lys-82引起hTrx1聚集沉淀，失去催化活性。Trx系统具有催化同型胱氨酸还原为同型半胱氨酸的能力。但是，在TrxR/Trx降低或氧化应激状态下，增加的同型胱氨酸水平将进一步抑制Trx活性。（2）血管内皮细胞的结构与功能在动脉粥样硬化发生中起关键作用。以Eahy926为细胞模型，我们发现同型半胱氨酸或同型半胱氨酸巯基内酯浓度低于1 mM处理24小时，无明显细胞毒性作用。但是，在相同时间内，100 μM同型半胱氨酸可在转录、蛋白及活性水平上增高TrxR，显著降低hTrx1，增加细胞内活性氧水平；引起ASK1-hTrx1复合物中ASK1含量增高，而hTrx1含量降低，促进JNK磷酸化，抑制p38磷酸化；50 μM同型半胱氨酸显著增高骨架蛋白表达量。因此，同型半胱氨酸在导致血管内皮细胞死亡之前，已引起显著的细胞结构与功能改变。（3）hTrx1也存在细胞外，与细胞表面组织因子结合抑制促凝血活性。增高的凝血活性与血栓性疾病发生密切相关。我们证实，血清Trx活性与总同型半胱氨酸水平（tHCy）呈反比。部分解释了高同型半胱氨酸血症往往伴随高凝血倾向。血清Trx活性/tHCy水平比值与冠脉受损显著相关，即比值越低，冠脉受损越严重。与常用的几种冠心病生物标志物比较，血清Trx活性/tHCy比值对冠脉损伤的诊断价值比较好。