miR-490通过调控NSP1表达抑制轮状病毒复制的作用机制研究

Rotavirus infection of intestinal epithlial cells is a major cause of infant diarrhea. Microarray analysis of microRNA expression profile in rotavirus infection of Caco-2 cells, we found that miR-490 was significantly downregulated. However, the precise role of miR-490 in rotavirus infection of intestinal epithlial cells remains unclear. Overexpression of miR-490 in Caco-2 cells infected with rotavirus, we found that miR-490 could decrease expression of rotavirus RNA and suppress the infectious virus titer, and significantly induce the expression of type Ⅰinterferon. The target genes of miR-490 in rotavirus genome would be predicted by web-base computer program. It found that nonstructural protein 1(NSP1)is a target gene of miR-490. Thus we assume that miR-490 inhibits rotavirus replication by regulating the NSP1 expression. The project intends to analyze the role of miR-490, and elucidate the molecular mechanisms of miR-490 in vivo and in vitro by qRT-PCR, fluorescent focus assay and RNAi methods. This study has a strong theoretical and practical value, which provides a new theoretical basis and latency target for effective treatment of rotavirus infection.

轮状病毒（RV）感染小肠上皮细胞，是婴幼儿腹泻的主要病因。应用生物芯片对RV感染肠上皮细胞Caco-2的microRNA表达谱分析后，发现miR-490在RV感染宿主细胞中的表达水平发生了显著的下调。但是miR-490在RV感染宿主细胞中表达改变的实际意义及生物学功能目前仍不清楚。我们前期在感染RV的Caco-2细胞中过量表达miR-490，发现它能抑制病毒RNA表达以及感染滴度，且显著诱导I型干扰素的表达。用生物软件预测miR-490在RV基因组上的靶基因是非结构蛋白1（NSP1）。我们推测miR-490可能通过调控NSP1表达抑制RV复制/感染的功能。本项目拟在RV感染体外/体内模型上，利用qRT-PCR、FFA和RNAi等技术方法，分析miR-490在RV感染的作用，阐明miR-490抵抗RV感染的作用机制，为有效治疗RV感染提供新的理论依据和潜伏靶点，具有较强的理论意义和应用价值。

轮状病毒是引起婴幼儿腹泻的主要病原体，属于呼肠弧病毒科，为无胞膜双链RNA病毒。它会感染小肠绒毛上皮细胞，造成细胞空泡和死亡，从而导致腹泻，有时候甚至会因为严重脱水而导致死亡。轮状病毒腹泻在全球已成为一项重要的公共卫生问题，给家庭和社会带来了巨大的经济和社会负担。microRNA（miRNA）在病毒防御、造血、器官形成、细胞增殖和凋亡、脂肪代谢、肿瘤发生等生命过程中发挥着重要作用。研究发现在感染轮状病毒的Caco-2和FHs74细胞中，miR-490表达显著下调，提示该miRNA可能与轮状病毒复制相关，但其作用机制目前不清楚。本项目首先构建miR-490真核表达载体并研究其对宿主细胞生理功能的影响，接着研究miR-490在轮状病毒感染人肠上皮细胞Caco-2中的作用，还研究miR-490作用靶点的验证以及诱导I型干扰素产生机制，最后研究miR-490在轮状病毒乳鼠腹泻模型中的体内作用。结果：（1）成功构建了pGenesil-1-miR-490真核表达载体，筛选出稳定表达miR-490的Caco-2细胞系，且miR-490对宿主细胞Caco-2的增殖和凋亡无影响。（2）miR-490过表达不但显著抑制轮状病毒的复制，抑制率约为60%，并且miR-490过表达能诱导IFN-α、IFN-β和IRF3蛋白表达升高，而抑制SOCS1蛋白表达。（3）萤光素酶活性分析发现pGL3-promoter-3'UTR与miR-490转染组可以下调NSP1基因3'–UTR区活性，提示NSP1是miR-490的作用靶点。（4）在乳鼠感染轮状病毒腹泻动物模型中发现miR-490可以抑制腹泻，改善粪便病毒脱落和小肠病理损害，增强IFN-α和IFN-β的表达。结论：研究表明miR-490通过靶向轮状病毒NSP1基因，直接抑制轮状病毒感染，也可以激活干扰素系统，间接增强宿主天然免疫来调控病毒感染。该研究有助于我们进一步理解轮状病毒感染的分子机制，为有效治疗轮状病毒感染提供新的理论依据和潜伏靶点，具有较强的理论意义和应用价值。