白花香莲解毒方通过miR-122靶基因调控网络抑制HBV复制的机制研究

microRNA is a newly discovered mechanism that the host interaction with the hepatitis b virus (HBV),play a key role in regulated HBV transcription and replication . MiR-122 high abundance ratios and specific expression in liver ,could multi-way suppress HBV replication at post-transcriptional level.Previous studies found that miR-122 down-regulated expression after hepatocytes infected with HBV, overexpression of miR-122 can inhibit HBV replication, Baihua Xianglian detoxification formula can raise miR-122 expression and reduce the level of HBV DNA. Proposed hypothesis that Baihua Xianglian detoxification formula inhibit HBV replication through miR-122 target gene regulation networks.Firstly,screening candidate signaling pathways and target genes by gene-chip and Bioinformatics methods,which Baihua Xianglian detoxification formula inhibit HBV replication through miR-122. Secondly,verify the signal pathway and target gene by signal suppression, gene overexpression,gene interference and luciferase reporter gene.Based on “miR-122-signal pathway-target gene” regulatory network,reveal molecular mechanism that Baihua Xianglian detoxification formula inhibit HBV.It has important significance for promoting the development of Zhuang folk medicine.

microRNA是一种新发现的宿主与乙肝病毒（HBV）相互作用的新机制，在调控HBV复制中发挥关键性作用。miR-122在肝脏内高丰度、特异性表达，可在转录后水平调控靶基因，多途径抑制HBV复制。前期研究发现，肝细胞感染HBV后miR-122表达下调，过表达miR-122能抑制HBV复制，壮药白花香莲解毒方能上调miR-122表达，并降低HBVDNA水平。据此提出“白花香莲解毒方通过miR-122靶基因调控网络抑制HBV复制”的假说。本项目首先利用基因芯片及生物信息学方法，筛选出白花香莲解毒方通过miR-122发挥抑制HBV复制作用的候选信号通路及靶基因；然后通过信号通路抑制、基因过表达、基因干扰及双荧光素酶基因报告等技术，验证信号通路及靶基因。项目将基于“miR-122-信号通路-靶基因”调控网络深刻揭示白花香莲解毒方“解毒补虚”抗HBV的分子机制，对促进壮医药发展具有重要意义。

围绕“白花香莲解毒方通过miR-122靶基因调控网络抑制HBV复制”的假说，课题组开展了以下四个步骤研究：（1）HBV全基因组1.3倍体HepG2稳转细胞模型构建与表达；（2）白花香莲解毒方调控miR-122通路抑制HBV的作用机制；（3）白花香莲解毒方抑制HBV的miR-122下游信号通路筛选及验证；（4）白花香莲解毒方抑制HBV的miR-122靶基因筛选及验证。结果发现：（1）新构建的HBV1.3P-HepG2稳转细胞模型能稳定表达HBV DNA、HBx、cccDNA、HBsAg、HBeAg等HBV标志物。（2）miR-122表达水平在感染HBV肝细胞较非感染HBV肝细胞表达下调；上调miR-122表达能抑制HBV DNA复制及HBeAg、HBsAg表达；白花香莲解毒方能提高感染HBV的肝细胞内miR-122表达水平，进而抑制HBV DNA的复制及表达。（3）筛选出白花香莲解毒方通过miR-122调控的下游信号通路，包括EGFR、Wnt、p53、氧化应激等通路。采用p53通路的抑制剂（即p53抑制剂Pifithrin-alpha）、wnt通路的激动剂（即Axin抑制剂SKL2001）进行验证，证实了抑制Axin或抑制p53信号通路均具有抑制HBV DNA复制及HBeAg、HBsAg表达的作用，其中抑制p53信号通路的作用更显著，故选择P53信号通路进行进一步的靶基因筛选与验证研究。（4）白花香莲解毒方通过miR-122作用于P53信号通路上的关键靶基因ARFGEF1/CCNYL1/CLIC4/CPEB1/FUNDC2/MEIS2/NO-D2/SPOCK2/SPRY2/TP53等，选择FUNDC2/MEIS2这2个靶基因进行验证研究，最后证实了FUNDC2是关键靶基因。结论：白花香莲解毒方可通过提高miR-122表达，下调P53信号通路上关键靶基因FUNDC2表达，抑制P53信号通路的传导，继而实现抑制HBVDNA复制及HBeAg、HBsAg表达的作用。