集胞藻PCC6803脂肪酸生物合成的反馈抑制作用研究

蓝细菌脂肪酸代谢的核心调控机制是反馈抑制作用，研究蓝细菌模式系统集胞藻PCC6803脂肪酸生物合成的反馈抑制作用，对于在新一代光合能源微生物系统蓝细菌中，构建优质新型脂肪酸类生物燃料产品的高效生物合成途径具有重要的理论研究意义和实际应用价值。.本项目将针对"如何在集胞藻PCC6803中有效释放脂肪酸生物合成反馈抑制作用"的关键科学问题，开展以下三方面的基础研究：集胞藻PCC6803中高效表达水解反馈抑制作用抑制剂脂酰载体蛋白的硫酯酶；鉴定集胞藻PCC6803中脂肪酸生物合成反馈抑制作用的目标蛋白；释放反馈抑制作用对集胞藻PCC6803游离脂肪酸的组成、含量、代谢流速的影响。目标是建立有效释放蓝细菌脂肪酸生物合成反馈抑制作用的机制，提升蓝细菌脂肪酸的定向生物合成能力，获得高产游离脂肪酸的基因工程蓝细菌，为未来蓝细菌生物合成脂肪酸类生物燃料奠定基础。

本项目针对“如何在集胞藻 PCC6803 中有效释放脂肪酸生物合成反馈抑制作用”的关键科学问题，目标是建立有效释放蓝细菌脂肪酸生物合成反馈抑制作用的机制，提升蓝细菌脂肪酸的定向生物合成能力，获得高产游离脂肪酸的基因工程蓝细菌，为未来蓝细菌生物合成脂肪酸类生物燃料奠定基础。. 本项目已经完成了多种不同来源硫酯酶基因在集胞藻PCC6803的异源表达，以及通过原核表达和体外纯化获得了集胞藻PCC6803脂肪酸合成途径多个关键蛋白。通过本研究大量工作发现，在蓝细菌中表达多个硫酯酶并未对脂肪酸产量有显著影响，直接制约了后续鉴定脂肪酸生物合成途径反馈抑制作用目标蛋白研究工作的开展。因此，基于对本项目研究目标“提升蓝细菌脂肪酸定向生物合成能力”的深入分析，基于对蓝细菌脂肪酸代谢途径的分析，调整了项目部分研究思路，针对蓝细菌反馈抑制作用抑制剂脂酰载体蛋白的关键合成步骤-脂酰辅酶A合酶/脂酰ACP合酶进行了深入研究，在酶学性质表征、生理功能和调控功能鉴定等多个方面开展了系统研究工作，获得了大量关于脂酰辅酶A合酶/脂酰ACP合酶对脂肪酸代谢影响的实验结果。通过大肠杆菌脂肪酰辅酶A合酶基因突变株XL100的互补实验，发现集胞藻PCC6803和鱼腥藻PCC7120来源的两个脂肪酰辅酶A合酶的候选基因slr1609和alr3602能够替代大肠杆菌脂肪酰辅酶A合酶基因的功能。其次，通过对这两个基因原核表达、体外纯化和酶活表征，进一步证实了这两个基因编码蛋白具有脂酰辅酶A合酶活性。而且，通过基因敲除技术，构建得到集胞藻PCC6803 slr1609基因突变株；并通过GC-MS分析发现，该基因缺失能够提高蓝细菌细胞内游离脂肪酸的含量，同时大幅降低脂肪烃的生物合成；证明了该基因在脂肪酸及相关衍生物生物合成中具有重要作用。而且该基因表达量对脂肪醇生物合成有一定正相关性。最后，通过基因芯片技术，比较分析了slr1609基因突变株和野生型转录谱的差异，发现包括脂肪酸脱饱和酶基因desD在内的299个基因差异表达，显示该基因在蓝细菌基因转录调控中发挥了重要作用。. 本项目证实了该蓝细菌脂酰辅酶A合酶在脂肪酸循环途径、脂肪烃合成途径、其他脂肪酸衍合成途径以及基因转录调控中的重要作用，为提升蓝细菌脂肪酸定向生物合成能力提供了基因工程改造的重要依据，也为未来蓝细菌生物合成脂肪酸族生物燃料奠定了基础。