集胞藻PCC6803中sll1981基因编码蛋白的功能研究

The protein encoded by sll1981 gene of Synechocystis sp. PCC6803 was previously identified as acetolactate synthase and L-myo-inositol 1-phosphate synthase, respectively. Our preliminary result shows that sll1981 protein also functions as alpha-ketoglutarate decarboxylase, which plays a key role in the newly discovered tricarboxylic acid cycle of cyanobacteria.. In this project, the substrate catalyzed by sll1981 protein will be identified by in vivo and in vitro enzymatic kinetics and the function of sll1981 protein will be elucidated. After that, the Synechocystis sp. PCC6803 mutant strains with sll1981 gene knock out or overexpression will be constructed by gene homologous recombination technique. By measuring the concentrations of important metabolites such as alpha-ketoglutarate and succinic acid, the role of sll1981 protein in the tricarboxylic acid cycle of Synechocystis sp. PCC6803 will be identified. With that the conversion pathway of alpha-ketoglutarate to succinic acid in Synechocystis sp. PCC6803 will be proved.

此前对集胞藻PCC6803中sll1981基因编码蛋白的功能研究存在争议。本课题组前期工作又发现sll1981蛋白具有alpha-酮戊二酸脱羧酶活性。这一发现对于深入理解集胞藻PCC6803的三羧酸循环具有重要意义。. 本项目将以sll1981蛋白为研究对象，通过体内体外酶动力学实验确定sll1981蛋白的催化底物，阐明sll1981蛋白究竟是一个催化多功能还是催化单一酶。通过测定sll1981基因缺失或过表达突变株中alpha-酮戊二酸，琥珀酸等重要代谢物的浓度验证sll1981蛋白在集胞藻PCC6803三羧酸循环中的作用，为阐明集胞藻PCC6803中alpha-酮戊二酸到琥珀酸转化途径提供生化证据。

此前对集胞藻PCC6803中sll1981基因编码蛋白的功能研究表明sll1981蛋白具有乙酰乳酸合成酶和肌醇磷酸合成酶功能。生物信息学分析表明sll1981蛋白极有可能具有alpha-酮戊二酸脱羧酶活性，这一活性对于集胞藻PCC6803三羧酸循环具有重要意义。因此本项目对sll1981蛋白的生理生化功能展开研究。.本项目主要研究内容包括：1、重组sll1981 蛋白的生化功能研究。通过构建pET32a-sll1981和pColdTF-sll1981两种质粒，获得了可溶性的sll1981蛋白，研究了sll1981蛋白作为乙酰乳酸合成酶、肌醇磷酸合成酶和alpha-酮戊二酸脱羧酶的酶动力学参数。2、胞内sll1981 蛋白的催化底物研究。构建sll1981 基因缺失或过表达突变株。采用全细胞破碎液直接转化外源添加的丙酮酸、D-葡萄糖-6-磷酸或alpha-酮戊二酸，研究sll1981蛋白的催化底物。.研究发现sll1981蛋白为一个双功能蛋白，具有alpha-酮戊二酸脱羧酶和乙酰乳酸合成酶功能。与文献报道的结果不一样的是本研究发现sll1981蛋白没有肌醇磷酸合成酶活性。此外，野生型藻株和sll1981基因缺失和过表达菌株细胞粗提液均没有检测到相应的alpha-酮戊二酸脱羧酶，乙酰乳酸合成酶和肌醇磷酸合成酶活性，原因可能是蛋白浓度较低。同时研究发现sll1981基因敲除使得集胞藻PCC6803的生长速度降低大约10%，而过表达sll1981基因基本不影响集胞藻PCC6803的生长。.本研究结果表明sll1981基因在集胞藻PCC6803中发挥一定的作用，但是可能不是集胞藻PCC6803三羧酸循环途径中的关键酶。