SAH后线粒体自噬缓解早期脑损伤的上游信号通路研究

Early brain injury is a crucial cause of high mortality and disability in spontaneous subarachnoid hemorrhage (SAH) patients. Our previous study have demonstrated that mitophagy plays a protective role in early brain injury after SAH by reducing apoptotic cell death. However, the upstream signalling pathway of mitophagy is unclear. HIF-1 expression is up-regulated in the acute phase after SAH. As far as we know, HIF-1 is the principal regulator of cellular transcriptional responses to hypoxia and plays an essential role in triggering cellular protection and metabolic alterations from oxygen deprivation. Nevertheless, there is little known about the role of HIF-1 in mediating mitophagy following SAH. BNIP3/NIX are found to be implicated in the process of mitophagy and mediated mainly by HIF-1. Therefore, we hypothesize that up-regulation of HIF-1 in adaptive responses to hypoxia following SAH induces BNIP3/NIX increase, then triggers mitophagy and finally promotes cell survival. We will use rat SAH model and cultured rat hippocampal neuron to test the hypothesis by performing HIF-1 inhibition, shRNA silence, etc. Our study will determine the mechanisms by which mitophagy reduces early brain injury and provide novel insights into SAH treatment.

早期脑损伤是自发性蛛网膜下腔出血(SAH)高死亡率和高致残率的一个重要原因，我们前期研究发现，SAH后线粒体自噬激活可以降低细胞凋亡水平，显著缓解早期脑损伤，但其上游调控机制尚不清楚。SAH急性期，缺氧诱导因子(HIF-1)的表达明显升高，HIF-1在细胞缺氧损伤和适应过程中起关键的调控作用，但是否参与SAH后线粒体自噬激活的过程，目前未见相关报道。最新研究表明，HIF-1可以直接调控BNIP3/NIX基因的转录，而BNIP3/NIX与线粒体自噬的发生密切相关。因此我们提出假说，SAH后神经细胞在缺氧条件下上调HIF-1，调控BNIP3/NIX基因的转录，进而激活线粒体自噬，最终减轻早期脑损伤。本研究将以大鼠SAH为模型，结合体内和体外实验，运用药物抑制、shRNA沉默等技术，来验证这一假说，以期阐明线粒体自噬缓解早期脑损伤的分子机制，从而为SAH的临床治疗提供新思路和理论依据。

【背景】 蛛网膜下腔出血（SAH）约占全部脑卒中的 5%~10%，具有死亡率高、致残率高的特点。我们研究发现，SAH 后自噬的激活可以通过降低凋亡水平显著缓解早期脑损伤，但具体分子调控机制尚不清楚。..【主要研究内容】 1. HIF-1在SAH 后早期脑损伤中的作用及可能的调控机制； 2. BNIP3/NIX 在SAH后在自噬调控通路中的作用；3. BNIP3/NIX与SAH后细胞凋亡及脑损伤的关系；4.SAH后丙戊酸减轻早期脑损伤的分子机制研究..【重要结果】 1. 明确HIF-1α介导了SAH后的神经元细胞自噬； 2.明确 BNIP3/NIX 是 HIF-1 在 SAH 后早期脑损伤过程中的下游调控蛋白；3、抑制BNIP3/NIX能降低SAH引起的细胞自噬及细胞凋亡，减轻脑损伤；4、丙戊酸可以通过HSP70/MMPs 及HSP70/Akt 通路减轻SAH后神经元的凋亡及早期脑损伤。 ..【关键数据】SAH后6h HIF-1α表达升高，24h达到峰值，给予HIF-1α的抑制剂2-MeOE2可抑制HIF-1α的表达，同时也抑制了SAH诱导的LC3上调。通过电镜观察，可见2-MeOE2能显著减少SAH诱导的自噬小体数量，以上结果说明HIF-1α介导了自噬的发生。此外，SAH可诱导BNIP3/NIX的mRNA及蛋白表达升高，BNIP3/NIX的siRNA转染细胞后，可抑制LC3上调，降低神经元细胞内自噬小体数量，减轻细胞的凋亡，但对HIF-1α的表达没有影响。而HIF-1α的抑制剂2-MeOE2抑制LC3的同时也抑制BNIP3/NIX表达，说明HIF-1α通过调控BNIP3/NIX 而介导了神经元细胞的自噬。我们进一步研究发现，丙戊酸处理可减轻SAH后的早期脑损伤及神经元凋亡。分子机制上，丙戊酸可上调HSP70表达，下调MMP-9的表达与活性，减少claudin-5、occludin降解。同时，丙戊酸可上调磷酸化Akt及Bcl-2表达。因此丙戊酸处理可减轻SAH后的神经元凋亡，其作用可能是由HSP70/MMP-9、HSP70/Akt信号通路介导。..【科学意义】 这些研究结果验证了我们原有的假说和结果，阐明了线粒体自噬缓解早期脑损伤的分子机制，而且更为SAH的临床治疗提供新思路和理论依据。