微小隐孢子虫IId亚型家族起源及区域独特性遗传结构形成机制

Cryptosporidium parvum is the most important species of zoonotic transmission from animal to human. Applicant finds that the C. parvum isolates in China all belong to family IId subtype, and documents analyses suggest the family IId is mainly emerged in the Middle Asia, especially in some countries in West Asia and Europe. Archaeological data certified that cattle and sheep originated from the West Asia and Central Asia. In addition, cattle and sheep are the important hosts for C. parvum. Thus, two hypotheses are proposed here: ① Cryptosporidium parvum has unique population genetic structure in China; ② C. parvum family IId originated from the West Asia, and dispersed to China and Europe followed by the livestock trades. Based on the above hypotheses, this project focuses on study the C. parvum isolates from cattle, sheep, and mice in five provinces in northwest of China representing the ancient Silk Road, and in Henan province representive of the center of ancient trades, and in comparison with the IId isolates from Iran, Bangladesh, Egypt, and Sweden, and others. Through population genetic structure by multlocus sequence typing (MLST), genome sequencing and analyzing of 5-7 common subtypes, as well as the analyses of transcriptome and expression pattern, to reveal the characteristics of Chinese C. parvum population genetic structure and transmission mechanism, host adaption mechanism, characterization of geographical segregation as well as the biological property of the origination and evolution of C. parvum family IId.

微小隐孢子虫是隐孢子虫病人兽共患传播的最重要虫种。申请者发现我国微小隐孢子虫目前仅见IId亚型家族，文献分析发现IId亚型家族主要分布在中东，尤其是西亚和欧洲一些国家。考古证明牛羊起源于西亚和中亚，牛羊是微小隐孢子虫最重要宿主。据此提出两个假说：1.我国微小隐孢子虫具有独特的群体遗传结构；2.微小隐孢子虫IId亚型家族起源于西亚，随牛羊贸易扩散传播到中国和欧洲。据此，申请项目重点针对古陆路丝绸之路的西北五省和古贸易中心河南的牛、羊和鼠源微小隐孢子虫分离株，并与伊朗、孟加拉、埃及和瑞典IId分离株相比较。基于多位点群体遗传结构分析、5-7个最常见基因亚型全基因组测序和分析，转录组和表达谱分析，揭示我国微小隐孢子虫群体遗传结构特征和传播机制，宿主适应机制，地理隔离特征和IId亚型家族起源和进化的生物学特征。

项目组在前期研究的基础上提出我国C. parvum具有独特的遗传特性和遗传结构，显著区别于世界其他国家。项目组经充分的研究发现我国奶牛感染的C. parvum亚型为IIdA14G1、IIdA15G1、IIdA15G2R1、IIdA17G1、IIdA18G1、IIdA19G1、IIdA21G1；牦牛IIdA15G1、IIdA18G1、IIdA19G1；马属动物IIdA19G1；鹿IIaA15G2R2、IIdA19G1；双峰驼If-like-A15G2、IIdA15G1；啮齿动物IIdA15G1；苍蝇携带IIdA19G1；进口引种场奶牛IIdA15G1。苍蝇携带亚型与栖息的奶牛场奶牛感染一致，奶牛感染均为IId亚型，鹿和骆驼体内发生了亚型的变异，在媒介动物鼠体内感染均为IId亚型家族（综合2009年的结果），提出C. parvum遗传独特性在我国广泛存在，媒介动物鼠和苍蝇在保种和传播中有一定的作用，在双峰驼和鹿体内出现适应性遗传变异。对来自瑞典、埃及和我国的111个C. parvum样品进行12个基因位点的多位点基因分型（MLST），形成25个MLST，在MLST中发现宿主适应性和显著的地理隔离现象。中国和瑞典C. parvum是克隆性群体结构，111个分离株形成3个祖先谱系。提出C. parvum IId起源于西亚，从西亚传播到世界其他地区的观点。通过GIS作图综合C. parvum亚型在全世界的分布情况，提出微小隐孢子虫IId亚型家族应该是C. parvum最早的一个“原型”；进入欧洲之后由于集约化、动物流动较快，从而加速其遗传变异，之后从欧洲进入美洲，北美国家养殖业的快速发展和集约化养殖，从而创造出更多的亚型。搭建了基因组组装和分析平台，建立了隐孢子虫卵囊免疫磁珠纯化分离技术和单卵囊分离技术对C. parvum IIdA19G1进行了重测序。建立卵囊纯化技术，进行分泌蛋白组分析，鉴定蛋白719个，定量蛋白626个，感染早期表达上调蛋白62个，下调表达蛋白32个。建立了C. parvum体内外感染模型，研究了微小隐孢子虫感染早期HCT-8细胞MicroRNA表达谱，在感染的细胞中有20个miRNA（(4个上调和16个下调))差异表达显著。这些结果为宿主适应性机制和致病机制的深入研究提供了坚实的理论和技术基础。