微小隐孢子虫跨种传播的分子机制

Cryptosporidiosis in humans is caused by the zoonotic pathogen Cryptosporidium parvum and the anthroponotic pathogen Cryptosporidium hominis.The two distinct parasites share an identical set of genes that differ by only 5% at the nucleotide level.Under natural circumstances, they have different host range,the mechanisum under which remains elusive.The molecular basis of ligand - receptor interaction would be helpful to elucidate the mechanisium of interspecies transmission of C.parvum.Previous reports indicate that micronemal proteins bind to host cells and may participate in parasite/cell attachment.Based on the bioinformatic analysis of the genome of C.parvum, the predicted microneme protein with adhensive domain will be chosed as target protein,and reletive protein encoding genes will be cloned and expressed in E.coli as GST recombinant protein.Then，enter primary bovine intestinal cells will be used to identify the binding capacity of these recombinant proteins. The selected protein will be served as the ligand of the parasite, and the distribution of the protein will be identified by immunoelectroscopy.Comparing the protein encoding gene in genome of C.parvum and C.hominis,the orthloge in C.homins will be cloned and expressed.The difference of these two recombinant proteins in binding enter primary bovine cells will be compared.The cells were treated with either heparinase，chondroitinase ABC,or with clostridium perfringens neuraminidase before infection,the effects of treatments in parasite invasion and ligand binding ability will be evaluated. These results will be confirmed by carbohydrate microarray.The present study will provide some evidient in elucidating the interspecies transmission mechanism of C.parvum.

微小隐孢子虫和人隐孢子虫在基因组水平上的差异只有5%，但感染宿主的范围却有很大差异，其机制尚不清楚。从分子水平上阐明两种虫体配体对宿主细胞受体的识别机制的不同有望揭示微小隐孢子虫的跨种传播机制。研究表明，微线体蛋白通过与宿主细胞结合而参与黏附和侵入过程。本研究首先用生物信息学分析具有黏附功能域的微小隐孢子虫分泌蛋白，并在大肠杆菌中制备重组蛋白。然后用体外培养的犊牛小肠上皮细胞筛选能够与之结合的重组蛋白。然后制备针对该蛋白特异性抗体，通过免疫电镜定位该蛋白在虫体内的分布。通过将该蛋白基因在人隐孢子虫基因组中比对，获得同源基因并制备重组蛋白。比对来源于两种虫体的同一蛋白对细胞结合特性的差异。通过将不同的糖分子与子孢子共孵育和采用不同的酶消化细胞表面糖分子，评价其对虫体侵入的影响和配体与细胞结合的影响。最后用糖芯片对配体与受体结合的结果进行验证。本研究将为阐明微小隐孢子虫的跨种传播机制提供依据。

隐孢子虫是一种重要的人兽共患原虫，可以感染多种动物和人，是一个重要的公共卫生隐患。在发达国家和发展中国家，隐孢子虫是造成腹泻的重要原因。在已经发现的隐孢子虫虫种和基因型中，C.parvum和C.hominis占隐孢子虫感染的90%以上。C.hominis主要引起人-人感染，C.parvum可以感染人和一些农场动物，尤其是断乳前奶牛和羔羊，因此可以在人与动物间传播。由于C.parvum和C.hominis基因组在核苷酸水平上的差异只有3%，所以认为导致两种虫体表型上的差异（宿主范围和宿主细胞的侵入特性）的原因主要是编码区细微的序列差异或重要基因表达水平上的差异，而不是基因组的重排和结构的改变。TRAP-C2是在所有顶器门原虫都存在的保守的TRAP家族蛋白成员。该蛋白与宿主细胞表面和微线体结构以及虫体表面黏附相关。因此，该蛋白的改变可能影响黏附特性和宿主范围。如果该假设成立，将可以解释为什么C.parvum的宿主范围与C.hominis不同，形成一个独特的传播循环。本研究制备了针对TRAP-C21277 EPKGAPLLYVDGDG-C1290 的多克隆抗体和单克隆抗体，用于TRAP-C2在虫体不同时期的定位分析。通过western-blot实验，在虫体的分泌蛋白、膜蛋白以及子孢子裂解蛋白中检测到了420KD的天然蛋白。间接免疫荧光定位发现其位于子孢子的顶端，而且与已经鉴定的微线体蛋白GP900共定位。细胞结合ELISA实验结果显示TRAP-C2与HCT-8细胞的结合特性明显高于其他蛋白。可见TRAP-C2是一个重要的微线体蛋白并且与黏附和入侵肠上皮细胞相关。但是，该蛋白的受体还需要进一步的鉴定。已经报道了基于TRAP-C2基因的nested-PCR/RFLP方法能够区分C.parvum和C.hominis。TRAP-C2蛋白序列的差异与宿主范围的关系尚需进一步研究。本研究也对其他TSP家族蛋白（CpTSP3、CpTSP4、CpTSP6）进行了研究，制备多肽抗体，通过western-blot实验，在虫体子孢子和卵囊裂解产物中分别检测到了55KD、55KD和43KD的天然蛋白。间接免疫荧光定位发现这些蛋白都位于子孢子的顶端，而且CpTSP3和CpTSP4与已经鉴定的微线体蛋白GP900共定位。由于它们都位于子孢子顶端，可能与虫体的黏附和入侵相关。