特定转录因子诱导小鼠成纤维细胞直接重编程为精原干细胞样细胞

Spermatogonial stem cells(SSC) are rare adult stem cells that can transfer genetic information to the offsprings in the body of male animals.This project aims to do direct reprogramming of somatic cells into spermatogonial stem cell-like cells (SSLC).First, a set of SSC transcription factors will be screened out for the direct reprogramming assay from 15 candidates that consist of Id4, Nanos2, Bcl6b, Etv5, Lhx1, Foxo1, Pou3f1, Pou5f1, Sox2, Klf4, c-Myc, Lin28, Utf1, Plzf and Taf4b; Second, the transcription factors will be introduced into mouse embryonic firoblasts or adult tail tip fibroblasts by retroviral vector pMXs; Third, the transduced fibroblasts will be maintained under SSC culture condition which contains glial cell line-derived neurotrophic factor(GDNF) to induce SSLC colonies; At last, the SSLC colonies with typical biological characteristics and fuctions of SSC will be screened out by the following criteria: expression of surface markers, expression of specific endogerous genes, transcriptome profile , methylation of imprinting genes, karyotype, haploid differentiation in vitro and differentiation in vivo via transplanting into testis. In conclusion, this project will clarify the pivotal transcription factors for determining SSLC fate from cellular reprogramming perspective; this project will also provide a new way for both male infertility treatment and transgenic animals production.

精原干细胞（SSC）是雄性动物体内能将遗传信息传递给后代的一类数量稀少的成体干细胞。本课题拟尝试将体细胞直接重编程为精原干细胞样细胞（SSLC）。从15个SSC候选转录因子（Id4、Nanos2、Bcl6b、Etv5、Lhx1、Foxo1、Pou3f1、Pou5f1、Sox2、Klf4、c-Myc、Lin28、Utf1、Plzf和Taf4b）中筛选出特定组合，通过逆转录病毒载体pMXs将其导入雄性小鼠胎儿成纤维细胞和成体尾尖成纤维细胞，在添加胶质细胞神经营养因子（GDNF）的SSC培养条件下进行诱导，以期获得SSLC克隆。通过对表面标记、内源特征基因、转录表达谱、印记基因甲基化、核型、体外单倍体分化和体内睾丸移植分化等指标鉴定，筛选出具有典型SSC生物学特征和功能的SSLC克隆。本项目将从细胞重编程角度阐明SSLC命运决定的关键转录因子，为男性不育治疗和转基因动物生产提供新的途径。

本项目主要克隆了22个精原干细胞转录因子(Id4, Nanos2, Bcl6b, Etv5, Lhx1, Foxo1, Pou5f1, Sox2, Klf4, c-Myc, Lin28, Utf1, Plzf，Taf4b，Dmrt1, Piwil2, Ddx4, Dazl, Hsf2, Zfp518a, Tcl1和Zscan12）。通过PMXs载体导入OG2×ICR雄性MEFs中，在精原干细胞培养条件下诱导30天后，未获得精原干细胞样克隆，RT-qPCR检测无显著内源生殖相关基因激活。此外，我们分别在小鼠和猪的体细胞中过表达OSKM诱导至中间态，再添加BMP4等诱导生殖细胞命运，但获得的克隆并不具有生殖干细胞特性，但具有介于naïve和primed状态之间的多能性特征。所以项目中期将研究方向调整为探索克隆的22个精原干细胞转录因子是否具有促进iPS细胞诱导效率的作用。我们为此获得了一系列原创性的发现，总结如下：（1）首次发现Etv5能够显著提高iPS细胞的诱导效率，并且证明获得的iPS细胞具有完整的多能性特征；（2）证明Etv5能促进MEFs发生MET转变；（3）发现内源Etv5激活是重编程过程不可或缺的重要事件；（4）发现ES细胞与精原干细胞一样具有高水平的Etv5表达，并且随着ES细胞的分化，Etv5的表达逐渐降低；（5）我们比较了小鼠ES细胞J1在内源Etv5 敲低以后与野生型J1的转录组差异，RNA-seq结果分析显示，Etv5敲低能够引起264个差异基因转录本的变化，这些差异表达基因显著影响了14 个KEGG 信号通路的变化。其中，对半胱氨酸和甲硫氨酸的代谢通路影响最为显著；（6）我们验证了受Etv5显著影响的差异基因，结果发现在小鼠ES细胞中Etv5的敲低能特异性引起Tet2基因的下调。（7）我们首次建立了Etv5-Tet2调控轴的关系，并且以此为理论基础，解释了Etv5-Tet2调控轴通过激活miR-200s家族，进而促进MET，最终促进重编程效率的分子机制。本项目研究结果的科学意义在于，揭示了精原干细胞与多能性细胞之间可能存在诸多类似Etv5的保守多能性调控因子，这为进一步挖掘新的多能性调控因子开辟了一条新的途径；Etv5-Tet2调控轴的发现，为理解Etv5在多能性建立、维持、退出和精原干细胞自我更新等生物学过程中的调控作用，提供了新的解释机制。