3株毛壳属植物内生真菌中特殊不对称二聚体生物碱chetomin新结构与生物合成机制研究

As the drug-like natural small molecules, alkaloid molecules are consistent with “Lipinski's Rule of Five”. After finishing the National Natural Science Foundation of China (31000011), we used UPLC-QTOF-MS/MS techniques to fingd 3 endophytic fungi Chaetomium sp., which could produce the uniquely structural alkaloids–chetomins with inhibitory activities against different cancer cells, and analysis of the the target C. globosum (CBS148.51) genome obtained the gene cluster of chetomin and predicted the functions of key genes. Based on the preliminary results, this project will investigate the following work: 1) To mine a series of chetomin alkaloids by optimization of culture media and by construction of the mutant strains with over-expressing the specific regulator gene in the chetomin gene cluster; 2) To investigate the functions of key genes, especially the function of gene shaping the N-C bond, and to elucidate the biosynthetic pathway of chetomins by using techniques of bioinformatics, molecular genetics and chemistry. If this project is supported, it will obtain the potentially anti-cancer candidate, and more importantly will understand the biosynthesis of chetomin alkaloids, and will pave a strong road for combinatory biosynthesis of this special member of alkaloids.

生物碱符合“成药5原则”，是成药性较高的一类天然有机小分子。在完成国家自然基金青年项目和后续研究工作基础上，基于超高压液质联用技术(UPLC-QTOF-MS/MS)从3株毛壳属植物内生真菌发酵物中发现了一系列具有抗肿瘤活性、特殊N-C键连接的不对称二聚体生物碱chetomin类似物。对其中1株C. globosum菌株的全基因组分析，获取了chetomin基因簇并对核心基因功能进行初步的研究。本项目拟对目标菌株产生chetomin生物碱的培养条件进行优化与构建chetomin基因簇专一调控因子过量表达的突变菌株，挖掘更多chetomin新类似物；结合生物信息学，分子遗传学和化学等学科阐明该类化合物生物合成途径，特别是对该化合物中独特N-C键的形成机制进行深入研究。通过本项目的实施可为抗肿瘤药物研发提供重要的备选化合物和为该类及类似N-C键连接不对称二聚体化合物的组合生物合成提供研究基础。

本项目在国家自然基金面上基金支持下，主要对C. Cochliodes中的chetomin的生物合成、结构与生物活性等进行了研究；此外，还过量表达球毛壳真菌中的LaeA和Hat基因，激活了2条沉默基因簇，发现了一些新的次级代谢产物；对多株荒漠植物内生真菌进行了化学成分与生物活性等方面研究：.1 对chetomin生物合成基因簇分析与验证：通过基因组测序，生物信息学分析获得chetomin类似物的生物合成基因簇，采用RT-PCR等方法初步证明了该簇与chetomin类似物的生物合成相关；.2阐明了chetomin类似物的光不稳定性：通过自由基捕获实验，电子自旋共振波谱法(EPR)与质谱捕捉中间体等方法，证实了光照诱发的硫自由基是导致多硫桥chetomin类似物不稳定的内在因素，并进一步构建了脱硫反应和歧化反应机制，从而解开了74年来困扰该类天然产物分离和难全合成的谜团；.3 基于基因功能、二聚体和单体结构特点构建了chetomin生物合成途径：根据单体和二聚体化合物的结构特征，构建了不同于美国化学家Williams曾经推测了chetomin化合物的生物合成途径；基于基因功能预测与分析，在培养基中加入氧化酶抑制剂，减少了二聚体的产生，同时增加了单体的含量，进一步支持了chetomin生物合成途径的正确性；.4 在球毛壳真菌中过表达LaeA和Hat基因，激活了2条沉默基因簇：以球毛壳真菌为研究对象，过量表达丝状真菌全局调控因子LaeA和组蛋白乙酰化酶Hat基因，激活了球毛壳基因组中chaetoglobosins和azaphilones的生物合成基因簇，发现了一系列具有抗肿瘤活性化合物；.5对4株荒漠植物内生真菌进行了化学与生物活性方面的研究：对4株荒漠植物内生真菌进行了化学成分与生物活性方面的研究，从中发现大量结构新颖、不同生物活性化合物，暗示荒漠植物内生真菌是天然产物研究的一个新资源。