人角化细胞三维培养体系中核转录因子YY-1的研究

皮肤的屏障功能是由角质形成细胞受精密调控表达分化特异性角化蛋白(CE相关蛋白群)来维持的。以往的CE蛋白群的相关研究均在人或小鼠角质形成细胞的单层培养体系中进行，与人的皮肤在结构和功能上有着显著的差异。由角质形成细胞构建一种既保留原有皮肤组织生理结构，又保证其功能的相对完整的立体器官样培养是角化细胞培养技术的新方向。项目主持人首次研究发现并证明：角化细胞培养体系中核转录因子YY-1在转录水平上抑制角质形成细胞分化表达CE蛋白而使细胞处于未分化状态，其结果在HaCaT细胞的三维培养系中也得到了证实。本项目把YY-1因子的表达调控研究，应用到人角化细胞的三维培养体系，检测三维体系中分化特异性CE蛋白群的表达及信息传导特征，为今后的皮肤组织的基础研究开创了更加接近人体皮肤的实验体系。这在研究皮肤组织的形成、分化、皮肤肿瘤的生成、转移方面有着重要的意义。

背景.皮肤的屏障功能由角质形成细胞受精密调控在不同的分化阶段合成不同的表皮角化蛋白相关蛋白群（CE）来维持。其中兜甲蛋白（loricrin）占CE的75%，其表达最基本的要素是Sp-1 /Sp-3和AP-1蛋白分子间近端启动子调控模型。而其结合位点下游的内含子区域存在着 YY-1的结合位点，而YY-1主要在未分化角质形成细胞中表达。.内容.1.建立表、真皮细胞器官样培养模型并对角质形成细胞CE重要相关蛋白表达进行评价。.2.利用基因转染(Electro Poration)和突变技术(Site-directed Mutagenis)，构建转录因子YY-1的慢病毒转基因体系，并进行确认。.3．研究基因操作改变的角质形成细胞CE重要相关蛋白在皮肤3D培养模型的特异蛋白表达，相关信息传导及3D培养模型在肿瘤发生发展中的应用。.主要结果.1..载体由质粒优化为转基因效率较高的转录因子YY-1的慢病毒转染体系，对重组和突变基因片段进行了确认。.2..YY-1慢病毒转染体系成功感染人永生化角化细胞株（HaCaT）之后，高钙条件下获得的单克隆细胞株过表达YY-1蛋白,可抑制K1、外皮蛋白和兜甲蛋白的合成，从而阻止表皮细胞角质化进程并使细胞处于未分化状态。.3..YY-1在基底层K5、K14中表达增加、棘层K1、K10表达降低、颗粒前丝聚合蛋白、兜甲蛋白和外皮蛋白表达显著下降。.关键数据.1、YY-1转染后的HaCaT细胞24h、48h、96h培养体系中实验组和对照组在细胞增殖和分化有显著差异（p<0.05）。.2、与慢病毒感染的HaCaT细胞组相比，在高钙条件下慢病毒-YY1感染HaCaT细胞组表皮内大量表达YY1时，早期分化标志物K1和晚期分化标志物外皮蛋白及兜甲蛋白的表达均显著降低（p<0.05）。.3、转染体系培养中，YY-1在基底层K5、K14中表达增加、棘层K1、K10中表达降低、颗粒层丝聚蛋白、兜甲蛋白和外皮蛋白表达显著下降（p<0.05）。.意义.本研究以基因治疗的首选载体慢病毒为感染载体应用到皮肤屏障相关的角质形成细胞分化特异性蛋白的研究，可有效地提高感染效率，实现目的基因在细胞内较长期稳定表达，优化了实验方案，提高了实验效率和可重复性。这有力证明核转录因子YY-1主要抑制分化，对角化细胞保持未分化状态有着重要的作用，也预示皮肤肿瘤的发生发展及转移的研究提供新方向。