三维培养体系中细胞集合增殖代谢的热化学和能荷特征研究

三维生长是所有生物体内细胞基本和真实的生活状态，三维细胞培养是组织工程、胚胎发育、药物筛选等研究的重要手段。三维培养通常采用微载体、微胶囊和组织工程支架等形式进行。由于三维生长细胞具有集合性、相互作用和状态非均一性，因此与平面培养及单细胞有很大不同，尽管有很好的应用需求但目前缺乏对三维细胞培养增殖代谢进行实时、动态和集合特征的研究手段。随着高灵敏微量热、能荷分析技术的发展，微尺度组织细胞水平增殖代谢集合评价研究已成为可能。本研究以微囊化和微载体三维细胞培养为模型，利用高灵敏微量热仪和能荷分析技术对不同条件三维生长类组织化细胞团进行增殖代谢特征测定，结合生物学手段对三维细胞团代谢进行动态跟踪、热化学表征和能荷分析，以获得三维生长细胞团生物热力学、增殖代谢动力学和生物学的集合对应信息，为生命体系代谢过程动态信息综合评价、细胞生物学研究和三维生长细胞模型应用提供物理化学表征的理论和技术基础。

三维细胞培养是组织工程、胚胎发育、药物筛选等研究的重要手段。但目前缺乏对三维细胞培养增殖代谢进行实时、动态和集合特征的研究手段。本研究对不同条件三维生长类组织化细胞团进行增殖代谢特征测定，获得了一系列三维生长细胞团生物热力学、增殖代谢动力学和生物学的集合对应信息，取得如下重要进展：①建立了可用于三维集合细胞在线刃天青活性检测方法，相比目前在微囊化细胞增殖活性检测中使用的其他方法，该方法具有原位、非侵入性、连续检测的优点，减少了由样本和操作带来的误差，尤其避免了现有检测方法中，由于三维培养结构限制所造成的对原始体系和种子细胞的破坏和浪费，更适合在类似的其他水凝胶包埋体系中应用和推广。②对三维生长细胞线粒体功能及脂、蛋白质合成能力及细胞胆固醇代谢与细胞功能改变之间的关系进行了研究；通过三维培养过程中添加渗透压和氧化应激的拮抗物质能够改善细胞功能，但影响程度不同。牛磺酸对三维细胞的活性和白蛋白水平均有显著提升作用；海藻糖对微囊化细胞活性有改善作用，但对细胞白蛋白分泌水平无明显影响。③采用八通道量热仪对不同培养方式下E. coli细胞（E. coli）；酿酒酵母细胞（S. cerevisiae）的增值代谢微量热进行了研究，结果显示三维培养的微生物与悬浮培养的热化学特性有明显差异，物质传递直接影响增值进而影响产热量值，为下一步动物细胞微量热测试提供了重要参考。④建立了肝癌细胞三维培养模型，三维培养状态下肝癌细胞的特征功能基因、转移能力、细胞粘附相关基因、肿瘤干细胞标记物表达上调，肿瘤干细胞得到富集：平面培养中肿瘤干细胞比例为0.7%，三维培养15天后增至2.83%。研究还显示肿瘤细胞恶性程度、转移能力和细胞能量代谢之间有一定关系，恶性程度高的细胞能量代谢旺盛，尤其在缺氧、代谢底物缺乏情况下能够很快的进行基因表达调节适应快速生长需求。⑤三维培养后肝细胞的内质网应激的分子伴侣（GRP78及其通路相关因子）表达上调，提示在三维体系中细胞存在内质网应激；三维培养后肝细胞的低氧诱导因子（HIF）表达上调，提示肝肿瘤细胞在三维体系中处于乏氧状态，与体内微环境相似。HIF参与肿瘤的血管生成、转移和侵袭并参与调节肿瘤干细胞自我更新和分化能力，抑制HIF的表达及转录活性有望成为一种新的治疗恶性肿瘤的途径。因此，利用本课题中构建的三维体系研究乏氧与肿瘤发生的相关性，有望为肿瘤的靶向治疗提供线索。