人退变软骨终板中祖细胞的确证及其特性的研究

随着对软骨终板退变与椎间盘退变的相关性研究不断深入，软骨终板的相关研究对阐明椎间盘退变的机制以及对椎间盘退行性疾病的治疗和预防都具有重要的意义。前期工作中，课题组发现在人退变软骨终板中部分软骨细胞存在一些干/祖细胞标志物的表达，且退变软骨终板细胞可以向成骨、成脂、成软骨方向诱导分化。此外，经成骨或成脂诱导后部分干/祖细胞标志物分子表达水平降低。本研究在前期工作的基础上，分离人退变软骨终板细胞，经琼脂糖悬浮培养系统筛选扩增后，体内外向成骨、成脂、成软骨以及成肌方向诱导分化，最终证实人退变软骨终板中存在具有多向分化潜能的祖细胞。此外通过人退变软骨终板中祖细胞与人骨髓间充质干细胞在细胞形态，细胞增殖活力，细胞表面标记物以及四系诱导分化后相关基因表达和组织学的比较，初步探讨软骨终板中祖细胞的生物学性质，为阐明软骨终板在椎间盘退变中的机制以及椎间盘的生物学治疗研究提供新的思路。

课题组已经按照课题计划完成课题研究，并且得到了良好的预期效果。目前已经完成以下几方面的研究：1. 从退变椎间盘软骨终板中分离出来的细胞进过琼脂糖筛选培养6周后，可见部分细胞可以形成克隆团，克隆团体外扩增培养后可以贴壁生长、形成细胞克隆、干细胞免疫表型(CD90、CD73、STRO1、CD105)表达为阳性，而CD14, CD19, CD34, CD45 和 HLA-DR表达量为阴性。体外三系诱导的组织学和基因鉴定结果证实分离出来的细胞可以进行成骨、成脂、成软骨方向诱导分化。2. 体内实验HE染色可见羟基磷灰石的孔隙中含有红染的均匀的基质。甲苯胺蓝染色提示具有异染的软骨基质形成。免疫组织化学结果证实Ⅰ、Ⅹ型胶原(collagen typeⅠ、Ⅹ，ColⅠ、 ColⅩ )在组织中表达丰富，而Ⅱ型胶原(collagen type，Col Ⅱ)在组织中表达量较少。3. CESCs与BM-MSCs在细胞形态、细胞增殖能力、细胞周期、细胞免疫表型、三系诱导分化中具有相似的性质。4. CESCs在成骨诱导的早期和晚期具有较强的成骨能力。在成脂能力上，BM-MSCs和CESCs无明显差异，但是，BM-MSCs成脂诱导过程中具有较大的变异性。在软骨诱导中，通过比较细胞球湿重、阿利新蓝密度、成软骨特异性基因表达量以及蛋白印迹(western blot，WB)，结果均表明CESCs具有较强的软骨形成能力。目前根据实验结果，我们已经发表SCI文章5篇，申请国家发明专利1项，国内核心期刊3篇，培养博士生3名，硕士生1名。以此课题为基础，我们又进行了深入研究，发现了软骨终板干细胞具有迁移的特点，因此又对其迁移的现象和机制进行研究并申请国科金2项。